研究背景与目的:心脏重塑是一种全球范围内严重的致死性疾病,其给患者造成了沉重的经济负担。心肌重塑包括心肌肥厚、心肌纤维化、炎症细胞的浸润,炎症因子的释放、间质的沉积、线粒体损伤、心肌细胞自噬调节机制的紊乱以及心肌细胞的凋亡,以上因素引起了终末期心力衰竭。血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张管-醛固酮系统的核心,其在心肌重塑中发挥了关键性的作用。血管紧张素Ⅱ引起心肌重塑的可能机制包括:血管紧张素Ⅱ通过引起血压升高引起心肌后负荷的增加、水钠潴留引起的心肌前负荷增加、机械牵拉刺激、血管紧张素Ⅱ引起各种促炎症因子以及炎症因子的释放、TGF-β1的表达过高和心肌间质的增殖与过度沉积。血管紧张素Ⅱ诱发的心脏重塑所带来高致病率以及高致死率促使人们研究改善心脏功能的各种药物,其中血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂在对抗血管紧张素Ⅱ引起的心脏重塑中发挥着重要的作用。然而,近年研究发现,在临床上尽管血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂逆转心脏重塑能够发挥有效的作用,它们的作用仍然是有限的,心脏重塑的全球发病率仍在不断上升。恼人的―醛固酮逃逸‖事件的发生也进一步限制了血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂在对抗心脏重塑上的功效。因此,通过探索新的可以对抗血管紧张素Ⅱ诱发心脏重塑的分子及其机制通路可能为血管紧张素转化酶抑制剂以及血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂的治疗提供更多思路,给心脏重塑患者带来新的治疗策略。Mst1,又名丝苏氨酸蛋白激酶4,作为Hippo/YAP信号通路的重要成分,它可以调节肿瘤的发生、调控细胞的增殖以及死亡。我们课题组先前的研究发现Mst1分子有可能在调节心肌细胞的自噬以及凋亡方面发挥着重要的作用,Mst1的过表达可以加重糖尿病心肌病小鼠心功能的恶化。但是,目前对于心肌细胞特异性的Mst1敲除在血管紧张素Ⅱ诱导心脏重塑中施加的作用以及具体的分子机制尚不明确。因此,本论文旨在探讨:1)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以对抗血管紧张素Ⅱ诱导的心脏重塑,包括是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以对抗血管紧张素Ⅱ诱导的心肌线粒体损伤。2)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除能够在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚、心肌纤维化以及高血压方面发挥作用。3)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以通过调节心肌细胞自噬流的途径来对抗血管紧张素Ⅱ诱导的心脏重塑,并且进一步的探讨其调控心肌细胞自噬流的机制。同时明确心肌细胞特异性的Mst1敲除通过调节心肌细胞自噬流来对抗血管紧张素Ⅱ诱导心脏重塑这一途径是否独立于血管紧张素Ⅱ受体而存在。4)是否心肌细胞特异性的Mst1敲除可以改善血管紧张素Ⅱ导致的心肌细胞凋亡,并深入研究其机制,包括心肌细胞特异性的Mst1敲除是否通过对抗ROS介导的JNK通路来缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡,而这一过程是否通过心肌细胞特异性Mst1敲除逆转血管紧张素Ⅱ诱导的Trx从ASK1分子上的分离,继而阻断血管紧张素Ⅱ诱导的ASK1-JNK促凋亡信号通路的激活来实现的。第一部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除鼠的产生研究目的:通过构建Mst1flox/flox小鼠和αMHC-Mer Cre Mer工具小鼠,最终在全球首次获得心肌细胞特异性的Mst1敲除小鼠:Mst1^Δ/Δ小鼠（予以他莫昔芬诱导的αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠）。研究方法:我们通过标准的Cre-Lox P方案来获取心肌细胞特异性的Mst1敲除小鼠。实施的步骤大致分为:成功构建心肌细胞特异性Mst1敲除的打靶载体（Lox P位点是A12242 to T12275 and A6695 to T6728;外显子是G13681 to A13724,T13561to T13620,C7270 to G7320 and G4350 to G4478）。随后,我们通过电穿孔将其递呈给ES细胞（C57BL/6背景）。接下来,我们对其进行了药物筛选,Polymerase Chain Reaction（PCR）鉴定和Southern blotting杂交鉴定。利用囊胚显微注射法以及随后的嵌合体生产,一定数量的克隆被筛选出来。然后,通过与苏州赛业公司提供的野生型小鼠进行杂交,―亚当与夏娃小鼠‖通过这种种系传递的方式取得。接下来,去NEO的杂合子突变小鼠（Mst1flox/+,3只雄性小鼠和4只雌性小鼠）被确定下来。通过F1代小鼠的交配,我们获得了F2代小鼠,并且通过PCR从F2代小鼠中鉴定出Mst1flox/flox小鼠。进一步,将Mst1flox/flox小鼠与来自于美国Jackson实验室的αMHC-Mer Cre Mer工具小鼠进行交配,F3代小鼠（αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/+mice）诞生了。通过将F3代小鼠（αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/+mice）与Mst1flox/flox小鼠进行回交,F4代小鼠诞生出来。接下来,通过PCR法筛选出F4代的Mst1flox/flox小鼠,并最终从F4代的Mst1flox/flox小鼠中鉴定出αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠,αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠的PCR鉴定产物是413bp的单一扩增条带。接下来,我们给6周龄以上的雄性αMHC-Mer Cre Mer:Mst1flox/flox小鼠腹腔注射他莫昔芬（40 mg/kg）,连续注射5天。考虑到他莫昔芬诱导Cre表达本身有诱发小鼠瞬间心肌病的风险,我们在建立动物模型前给予小鼠以7周的恢复期。因为他莫昔芬诱导Cre表达所导致的瞬间心肌病在5周后自然消失。最后,在动物模型建立前我们通过PCR和Western blotting的方法确定成年鼠心肌组织中Cre酶表达的效率以及心肌细胞特异性的Mst1敲除效果。并且通过心脏超声评估小鼠基线的心功能情况。研究结果与研究结论:全球首例心肌细胞特异性的Mst1敲除小鼠被成功构建。第二部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心功能障碍以及线粒体损伤的影响研究目的:明确心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌失功能以及线粒体损伤的影响研究方法:Mini-osmotic微泵埋植在小鼠肩胛骨之间的皮下。该泵灌满通过无菌生理盐水配置的血管紧张素Ⅱ溶液（1000ng/kg per/min）,持续灌注达46天（按照灌注总体积以及流速流量换算的最大灌注时间是48天）。对照组灌注等体积的生理盐水。通过电脑生成随机数的方式将Mst1^fl/fl和Mst1^Δ/Δ小鼠以随机分配的方式分配给对照组以及血管紧张素Ⅱ干预组。各种在基线水平上具有相似的血压、血流动力学相关指标以及心脏的结构形态学参数。小鼠的分组方法如下:（1）Mst1^fl/fl;（2）Mst1^Δ/Δ;（3）Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl;（4）Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ（每组有9只小鼠）。7周后,这些小鼠被处死。在处死小鼠前,小鼠的各项无创的心脏超声指标（LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD）以及各项有创的心功能指标（LVSP、LVEDP、d P/dtmax、negative d P/dtmax）被再次评估,接下来,我们评估了这些小鼠的心脏形态学指标。在离体,我们通过JC-1来评估原代心肌细胞的线粒体膜电位,通过TEM和FCM来评估原代心肌细胞的线粒体肿胀程度,通过增强型ATP生物发光分析试剂盒来评估各组小鼠心肌中线粒体ATP的含量水平,继而评价各组小鼠心肌中线粒体的功能。研究结果:1.在Ang Ⅱ微泵灌注的小鼠中,改善的LVEF和LVFS以及回收的LVESD反映心肌细胞特异性的Mst1敲除缓解Ang Ⅱ诱导的心脏失功能。2.Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组的LVSP和positive dp/dtmax指标比Mst1^fl/fl组更高。这反映出Ang Ⅱ模型小鼠出现代偿性的心肌收缩能力增加,以此来对抗Ang Ⅱ引起的心脏压力负荷的增加。3.Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组的LVEDP和negative dp/dtmax参数较Mst1^fl/fl组下降。这反映出Ang Ⅱ引起小鼠心脏舒张功能的降低。Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ组的LVEDP和negative dp/dtmax参数较Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组回升,反映出心肌细胞特异性的Mst1敲除能够改善Ang Ⅱ引起小鼠心脏舒张功能的降低。4.在Ang Ⅱ干预的环境下,转染以AD-sh-Mst1的原代乳鼠心肌细胞呈现出更多的JC-1红色荧光和更少的JC-1绿色荧光。5.TEM显示Ang Ⅱ干预可以诱发明显的线粒体超微结构的损害,Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ组的线粒体超微结构损伤较Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组明显减轻。6.反映线粒体肿胀程度的流式FSC/SSC显示Mst1^Δ/Δ能够有效减轻Ang Ⅱ引起的心肌线粒体的肿胀。7.在慢性Ang Ⅱ微泵灌注组中,Mst1^Δ/Δ能够有效增加线粒体ATP的含量。研究结论:1.心肌细胞特异性的Mst1敲除能够有效的缓解Ang Ⅱ诱导的心脏失功能。2.心肌细胞特异性的Mst1敲除也能够减轻Ang Ⅱ引起的心肌线粒体损害。第三部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚、心肌纤维化以及高血压的影响研究目的:明确心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ诱导的心肌向心性代偿性肥厚、不良的心肌离心性肥厚、心肌纤维化以及高血压的影响。研究方法:小鼠被处死后,迅速清洗心脏,去除血液和水分后统计HW/BW and HW/TL指标。然后将每个样本的左心室横截面切片予以固定高度和位置,进行H&E染色。通过3DHISTECH软件来评估H&E染色的左心室切片LVWT和IVST指标。心肌细胞长轴、心肌细胞短轴和心肌细胞横截面积通过软件Image-Pro Plus 6.0,采用H&E染色和WGA染色进行评估。考虑到Ang Ⅱ干预还可导致左心室出现适应不良的离心性肥厚,对外不但呈现出心肌细胞延伸,还可以表现出心肌细胞的凋亡加重。因此,每个左心室标本也被连续切成6μm厚的切面,每个切片都予以TUNEL染色来评价心肌细胞的凋亡率。RT-PCR和Western blotting用来评价ANF和β-MHC的m RNA表达水平和蛋白质表达水平。接下来,我们采用马松三色法以及天狼星红染色来评价各组左心室心肌纤维化程度。马松切片通过扫描仪扫描后采用pannoramic viewer软件进行评估左心纤维化程度。造模型期间,我们采用鼠尾无创血压检测系统来评估各组小鼠的舒张压,收缩压以及心率情况。各只小鼠的血压以及心率每两天检测一次。研究结果:1.虽然慢性Ang Ⅱ微泵灌注引起小鼠HW/BW和HW/TL以及LVWT和IVST指标的升高,Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组的上述指标并未看到显著差异。无论是通过H&E染色,还是通过WGA染色来评估心肌细胞长轴、心肌细胞短轴和心肌细胞横截面积,也都体现出同HW/BW、HW/TL、LVWT和IVST等指标相一致的趋势。2.无论是在体实验还是离体实验,ANF和β-MHC的各项RT-PCR和Western blotting结果均提示心肌细胞特异性的Mst1敲除不能够明显改善Ang Ⅱ诱导的左室心肌代偿性的向心性肥厚。3.心肌细胞特异性的Mst1敲除能够改善Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡,减轻Ang Ⅱ诱导的左室心腔扩张（LVESD的减少）,反映心肌细胞特异性的Mst1敲除有可能改善Ang Ⅱ诱导的不良的左室心肌离心性肥厚。4.马松以及天狼星红染色结果提示:Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组的左室纤维化程度没有明显区别。5.无创压力血压检测系统提示:各组小鼠的心率、舒张压以及收缩压在慢性Ang Ⅱ微泵灌注实验开始时没有显著差异;46天后,Ang Ⅱ微泵组小鼠的心率、舒张压以及收缩压均显著高于其相应的对照组。然而,心率、舒张压以及收缩压在Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组之间没有显著的差异。研究结论:1.心肌细胞特异性的Mst1敲除不但能够通过缓解心肌细胞凋亡、改善心脏舒张功能、减轻左室心腔扩张来对抗Ang Ⅱ诱导的不良类型左心离心性肥厚,减轻Ang Ⅱ诱导的左心容量超负荷的不良影响;而且心肌细胞特异性的Mst1敲除并不减弱Ang Ⅱ诱导的左心代偿性向心性肥厚,而左心室代偿性的向心性肥厚有助于在一定程度上帮助维系Ang Ⅱ微泵灌注小鼠的心功能以对抗Ang Ⅱ诱导的压力超负荷（左心室代偿性的向心性肥厚维系小鼠的心功能以对抗Ang Ⅱ诱导的压力超负荷是通过拉普拉斯法则来实现的）。2.心肌细胞特异性的Mst1敲除对于Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化和高血压的影响是微乎其微的。第四部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于血管紧张素Ⅱ干预的小鼠心肌细胞自噬流的影响及其机制研究研究目的:探讨是否心肌细胞特异性的Mst1敲除能够通过改善血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌细胞自噬流来减轻血管紧张素Ⅱ引发的心肌重塑,并进一步探究其深层机制。明确该作用是否能够独立于血管紧张素Ⅱ的1型受体和2型受体。研究方法:在体实验以及离体实验中,采用Western blotting方法检测LC3-Ⅱ/LC3-I、P62/GAPDH、Beclin1/GAPDH、p-JNK、JNK、p-Erk1/2、Erk1/2、Cleaved caspase-3/caspase-3和Bax/GAPDH的表达水平。在体实验中,我们也通过IF和IHC法来检测心肌组织中LC3的表达水平。对于离体细胞实验,我们采用酶解法从1到3日龄的乳鼠左心室中获取原代心肌细胞,原代心肌细胞的培养基为含10%胎牛血清的细胞培养基,其中加入1%的青链霉素双抗。将含有红色和绿色荧光标签的双标荧光蛋白（GFP-m RFP-LC3）转入原代乳鼠心室肌细胞后24小时,再将Mst1 sh RNA（AD-sh-Mst1）腺病毒和Mst1 sh RNA的对照空载体（Ad-Lac Z）腺病毒转入原代心室肌细胞中,注意感染腺病毒4小时后及时换液。36小时后,我们采用Ang Ⅱ（10μmol/l）或者等体积的PBS干预乳鼠原代心室肌细胞达24小时。采用激光共聚焦显微镜观察黄点（代表自噬体）以及红点（代表自噬溶酶体）的表达水平。分离获得原代乳鼠心室肌细胞后按照如下方法进行分组:（i）Control;（ii）Control+Ad-Lac Z;（iii）Control+Ad-sh-Mst1;（iv）Ang Ⅱ;（v）Ang Ⅱ+Ad-Lac Z;（vi）Ang Ⅱ+Ad-sh-Mst1。进一步,我们采用AO染料染原代心室肌细胞,AO染料的红点可以视为反映自噬溶酶体表达水平的一个初步指标;并且采用激光共聚焦显微成像系统观察P62的表达程度。为了进一步明确由心肌细胞特异性Mst1敲除所引发的心肌细胞自噬流增加是否在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌重塑中发挥有益的保护性作用以及为了进一步明确是否心肌细胞特异性Mst1敲除诱导心肌细胞自噬流增加这一效应独立于血管紧张素Ⅱ受体,我们将剩余的小鼠进行重新造模,并且分别予以自噬抑制剂3-MA以及血管紧张素Ⅱ的1型受体阻滞剂络沙坦干预。一部分小鼠予以腹腔注射自噬抑制剂3-MA（每天10 mg/kg）达14天。小鼠分组如下:（1）Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl;（2）Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl+3-MA;（3）Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ;（4）Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ+3-MA（每组含有5只小鼠）。各组在实验开始前具有相近的血压、心脏形态学参数以及血流动力学指标。7周后,每只小鼠分别采用心脏超声评估LVEF,LVFS,LVESD和LVEDD这些指标。另一部分小鼠采用饮用水中加入血管紧张素Ⅱ的1型受体阻滞剂络沙坦（0.8g/L）的方式来予以干预。我们将这些小鼠按照如下方式进行分组:（1）Mst1^fl/fl;（2）Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl;（3）Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ;（4）Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl+losartan;（5）Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ+losartan（每组含有5只小鼠）。各组同样在基线水平上具有相近的血压、心脏形态学参数以及血流动力学指标。离体水平上,我们采用针对AT1a受体基因的RNA干扰质粒（p AT1a）以及血管紧张素Ⅱ的2型受体抑制剂PD123319来分别干预原代乳鼠心室肌细胞,并进行相关研究。研究结果:1.无论是在体实验、离体实验,还是Western blotting实验均发现:与对照组相比,血管紧张素Ⅱ微泵干预组具有轻度上调的LC3-Ⅱ/LC3-I和Beclin1表达水平以及轻度下调的P62表达水平。IF以及IHC实验也揭示出血管紧张素Ⅱ干预引起心肌组织中LC3表达水平的轻度上升。在离体的原代乳鼠心室肌细胞中,同其相应的对照组相比,我们观察到血管紧张素Ⅱ干预组具备较轻幅度增加的AO红点以及较小幅度降低的P62红点。相似的,在转染AD-GFP-m RFP-LC3的原代心肌细胞中,血管紧张素Ⅱ干预引发心肌细胞内自噬体以及自噬溶酶体数目的较轻幅度增加。在体实验,在血管紧张素Ⅱ微泵干预的小鼠中,自噬抑制剂3-MA进一步加重了血管紧张素Ⅱ引发的心肌重塑,因为我们在Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl+3-MA组小鼠中观察到LVEF和LVFS值较Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组进一步降低以及cleaved caspase-3/caspase-3和Bax表达水平较Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组进一步升高。2.无论是在体实验还是离体实验,Mst1^Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ组都具备相近的LC3-Ⅱ/LC3-I,P62以及Beclin1的表达水平。IHC以及IF实验同样揭示出Mst1^Δ/Δ组和Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ组的心肌组织中具有相似的LC3表达水平。进一步,我们发现,在转染AD-GFP-m RFP-LC3的乳鼠原代心室肌细胞中,Ad-sh-Mst1组和Ang Ⅱ+Ad-sh-Mst1组具有相似的自噬体以及自噬溶酶体数目。3.在血管紧张素Ⅱ微泵干预的小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除显著增加LC3-Ⅱ和Beclin1的表达水平,显著降低P62,cleaved caspase-3/caspase-3和Bax的表达水平。同时,透射电镜也揭示出在血管紧张素Ⅱ微泵干预的小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除组呈现出更多的自噬体数目以及更轻的心肌线粒体损伤。4.在离体实验中,抑制Mst1基因的表达进一步促进血管紧张素Ⅱ干预的原代心室肌细胞内自噬流的增加,因为我们观察到胞浆内更多的GFP-m RFP-LC3点以及显著增加的AO红点伴随有明显降低的P62红点。采用RNA干扰质粒（p AT1a）抑制血管紧张素Ⅱ的1型受体表达的条件下,抑制Mst1基因仍然可以显著促进原代心室肌细胞内自噬流的增加。予以自噬下游阻断剂氯喹干预的情况下,抑制Mst1基因同样可以进一步增加血管紧张素Ⅱ干预的原代心室肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-I的表达水平,进一步降低其P62的表达水平。5.在自噬抑制剂3-MA干预的情况下,心肌细胞特异性的Mst1敲除改善血管紧张素Ⅱ诱导的心功能减退以及降低血管紧张素Ⅱ诱导心肌凋亡的效果消失。6.IF实验揭示出络沙坦降低心肌组织中LC3的表达,但是即使在用络沙坦阻滞血管紧张素Ⅱ的1型受体功能的条件下,心肌细胞特异性的Mst1敲除仍然能够显著增加小鼠心肌组织中LC3的表达。TUNEL实验也揭示出虽然络沙坦可以一定程度的降低血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡,相比于Ang Ⅱ+losartan+Mst1^fl/fl组,Ang Ⅱ+losartan+Mst1^Δ/Δ组小鼠左室心肌组织中的心肌细胞凋亡率仍然能够进一步降低。Western Blotting的实验结果与TUNEL和IF实验的结论一致。在用络沙坦阻滞血管紧张素Ⅱ 1型受体功能的条件下,心肌细胞特异性的Mst1敲除不但可以继续显著增加Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-I的表达水平,显著降低P62的表达水平,还能够继续明显减弱心肌组织中血管紧张素Ⅱ诱发的caspase-3以及Bax的激活。7.在离体实验中,我们发现抑制Mst1基因表达能够逆转血管紧张素Ⅱ诱导的JNK磷酸化,即使采用针对AT1a受体基因的RNA干扰质粒（p AT1a）显著抑制血管紧张素Ⅱ的1型受体表达的情况下,抑制Mst1基因表达仍然能够有效逆转JNK的磷酸化。另一方面,抑制Mst1基因表达却无法降低血管紧张素Ⅱ诱发ERK1/2的磷酸化,而此信号通路是血管紧张素Ⅱ受体下游通路的重要组成部分。研究结论:1.血管紧张素Ⅱ干预所引发的心肌细胞轻度自噬流上调效应是心肌细胞胞内的一种有效的自我代偿性保护机制,在这种条件下,上调的自噬流可以通过清除受损的细胞器、加速受损蛋白质的清除以及再循环来减轻损伤、保护心肌,从而对抗血管紧张素Ⅱ引起的心脏重塑。更加重要的是,血管紧张素Ⅱ干预所引发的心肌细胞自我代偿性保护效应依赖于对Mst1分子的抑制。因为在心肌细胞特异性Mst1敲除的状态下,血管紧张素Ⅱ干预无法再进一步增加心肌细胞的自噬流。2.心肌细胞特异性的Mst1敲除通过增强心肌细胞胞内自噬流来缓解血管紧张素Ⅱ诱发的心肌重塑,而且该效应独立于血管紧张素Ⅱ受体而存在。3.尽管血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂在临床上广为使用且可以一定程度的改善血管紧张素Ⅱ诱导心肌重塑,本研究发现血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂却抑制了心肌细胞胞内的自噬流,而自噬流是心肌细胞对抗心肌重塑的重要代偿保护性机制。这有可能暗示着血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂在临床治疗上具有其局限性,也能够解释为何临床上有部分患者在规范服用血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂后仍然出现心肌重塑。4.心肌细胞特异性Mst1敲除增强心肌细胞自噬流对抗血管紧张素Ⅱ诱发心肌重塑的分子机制是通过上调Beclin1的表达水平和抑制JNK的磷酸化来实现的。5.即使在阻滞血管紧张素Ⅱ 1型受体的功能或者下调血管紧张素Ⅱ 1型受体表达的条件下,心肌细胞特异性Mst1敲除仍然可以抑制JNK的磷酸化和上调Beclin1的表达水平。第五部分:心肌细胞特异性的Mst1敲除对于缓解血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌细胞凋亡的机制研究研究目的:进一步探讨心肌细胞特异性的Mst1敲除缓解血管紧张素Ⅱ诱导小鼠心肌细胞凋亡的具体机制。研究方法:常规的小鼠分组方式如前。进一步,为了消除心肌组织ROS的影响,我们采用ROS清除剂NAC（每天50mg/kg）腹腔注射小鼠。Mst1^fl/fl小鼠与Mst1^Δ/Δ小鼠被随机分入Ang Ⅱ组或者Ang Ⅱ+NAC组。分组方式如下:（1）Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl;（2）Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl+NAC;（3）Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ;（4）Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ+NAC（n=6只小鼠每组）。各组在实验开始前具有相似的血压、心脏形态学参数以及血流动力学指标。46天后,我们通过心脏超声来评估各只小鼠的LVEF,LVFS,LVESD和LVEDD。接下来,将小鼠处死,进行H&E染色、IHC实验、TUNEL实验和IF实验。p-JNK的IHC采用石蜡包埋切片后微波抗原修复法。然后测定心肌组织内超氧化物的含量,我们将小鼠的部分左心室组织采用OCT包埋剂迅速冰冻并且采用冰冻切片机切成8μm厚的冰冻切片,注意尽量保持各只小鼠左心室横截面高度位置的一致性。每只小鼠左心室选取3个截面。采用DHE荧光探针（5mmo/l）37度环境下避光孵育组织切片达30分钟,接下来用激光共聚焦显微镜评估DHE荧光探针的荧光强度。在体实验中,获取心脏组织TUNEL切片后采用数字扫描仪对整张切片进行扫描,获取整张切片的扫描图后利用Pannormamic viewer软件对凋亡的心肌细胞进行统计分析。为了检测Trx与ASK1在小鼠心肌组织中的共定位情况,我们采用序贯的免疫荧光双染法。为进一步明确Trx与ASK1在小鼠心肌组织中的结合情况,我们实施了COIP法。在离体研究中,乳鼠原代心室肌细胞从1-3天的C57BL/6小鼠的左心室中采用酶解法获取。Ad-sh-Mst1和Ad-Lac Z被成功构建以及分选出来。腺病毒的滴度是1.26*1010 PFU/ml.实验采用的病毒重复感染率是100:1,其sh RNA序列是CCCGTTTGTTAAGAGTGCCAAAGGA。在转染Ad-sh-Mst1（adenoviruses harbouring Mst1 sh RNA）以及Ad-Lac Z（control vectors for Mst1 sh RNA）36小时后,乳鼠原代心室肌细胞被施加以Ang Ⅱ（10μmol/l）干预或者等量的PBS干预24小时,同时,予以抗氧化剂NAC（1mmo/l）干预部分乳鼠原代心室肌细胞。进一步,采用DCFH-DA荧光标签来评估接种在激光共聚焦皿中的乳鼠原代心室肌细胞胞浆内ROS水平。离体实验中,我们采用激光共聚焦显微镜观察JNK核转位情况,因为JNK的核转位可以反映JNK的活化情况。为了统计各组原代心室肌细胞的坏死情况与凋亡情况,我们在离体实验中采用AO/EB双染的免疫荧光法。最后,采用商业化的试剂盒来检测各组的胞内MDA、SOD、T-AOC以及线粒体ATP含量。研究结果:1.TUNEL实验揭示出相比于Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl组,心肌细胞特异性的Mst1敲除组可以有效的降低血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡。Western blotting实验也表明血管紧张素Ⅱ干预引起cleaved caspase-3/caspase-3和Bax表达水平的升高,心肌细胞特异性的Mst1敲除可以有效减弱血管紧张素Ⅱ诱发的cleaved caspase-3/caspase-3和Bax表达水平的升高。2.血管紧张素Ⅱ干预可以有道心肌组织内p47phox表达量的增加,心肌细胞特异性的Mst1敲除可以阻止这一过程的发生。3.血管紧张素Ⅱ干预使得心肌组织中DHE荧光强度显著增加,这一效果被心肌细胞特异性的Mst1敲除所抑制。IHC实验表明:血管紧张素Ⅱ干预诱发小鼠心肌组织内JNK的磷酸化,而心肌细胞特异性的Mst1敲除阻断这一过程的发生。Western blotting实验也表明血管紧张素Ⅱ干预增加了心肌组织内JNK和ERK1/2的磷酸化水平,心肌细胞特异性的Mst1敲除可以抑制血管紧张素Ⅱ诱发的JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）的激活,但是心肌细胞特异性的Mst1敲除不能够抑制血管紧张素Ⅱ诱发ERK1/2的活化。4.在血管紧张素Ⅱ微泵灌注的小鼠中,给予NAC干预可以有效抑制血管紧张素Ⅱ诱发的心肌细胞胞内ROS生成,缓解线粒体损伤,这通过DHE荧光密度的下降、MDA水平的下降以及SOD以及T-AOC水平的升高反映出来。在NAC干预的血管紧张素Ⅱ微泵灌注小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除不能进一步抑制活性氧自由基的生成。在血管紧张素Ⅱ微泵灌注的小鼠中,予以NAC治疗可以有效降低JNK磷酸化水平。然而,在NAC干预的血管紧张素Ⅱ微泵灌注小鼠中,心肌细胞特异性的Mst1敲除不能进一步降低心肌组织JNK磷酸化水平。相似地,在NAC干预的血管紧张素Ⅱ微泵灌注小鼠中,TUNEL实验以及H&E染色实验结果提示NAC治疗可以缓解血管紧张素Ⅱ引发的心肌病理改变和降低血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞凋亡。但是,我们在Ang Ⅱ+Mst1^fl/fl+NAC组与Ang Ⅱ+Mst1^Δ/Δ+NAC组之间没有观察到显著的心肌病理结构改变以及心肌细胞凋亡的差异。5.在离体实验中,抑制Mst1表达有效缓解血管紧张素Ⅱ诱导的原代心室肌细胞的凋亡,这通过Mst1抑制显著缓解了血管紧张素Ⅱ引发的原代心肌细胞胞浆内cleaved caspase-3和Bax表达水平升高来体现出来。此外,我们还发现:血管紧张素Ⅱ干预引起乳鼠原代心肌细胞凋亡率以及坏死率的增加,抑制Mst1表达可以有效缓解血管紧张素Ⅱ干预引起的乳鼠原代心肌细胞凋亡率以及坏死率增加,这通过AO和EB双染实验体现出来。离体实验中TUNEL实验结论同AO/EB双染实验结果相一致。6.在原代乳鼠心室肌细胞中,NAC处理或者Mst1抑制都可以缓解血管紧张素Ⅱ诱发的胞浆内ROS生成,可是在血管紧张素Ⅱ干预并且给予NAC处理的乳鼠心室肌细胞中,再予以Mst1抑制不能进一步降低胞浆内ROS的生成。同样地,血管紧张素Ⅱ促进乳鼠原代心室肌细胞JNK的核转位,该效应可被NAC处理或者Mst1抑制所阻止,可是在血管紧张素Ⅱ干预并且给予NAC处理的乳鼠心室肌细胞中,继续予以Mst1抑制不能再进一步阻止乳鼠原代心室肌细胞JNK的核转位。Western blotting提示血管紧张素Ⅱ干预引起JNK的磷酸化（Thr183/Tyr185）以及ERK1/2的磷酸化,给予NAC处理可以有效缓解血管紧张素Ⅱ诱发的JNK和ERK1/2的激活。抑制Mst1表达可以有效的逆转血管紧张素Ⅱ诱发的JNK磷酸化,但是抑制Mst1表达对于血管紧张素Ⅱ干预引发的ERK1/2的磷酸化没有造成显著影响,这个结论与之前我们在在体实验中得到的结论相符合。在血管紧张素Ⅱ干预同时给予NAC处理的乳鼠原代心室肌细胞,继续抑制Mst1的表达不能够再进一步的逆转JNK磷酸化。7.在离体实验中,抑制Mst1表达能够减弱血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠原代心室肌细胞胞浆内ROS水平的升高,改善心肌细胞线粒体功能,依据在于Ang Ⅱ+Ad-sh-Mst1组可以观察到胞浆内显著的DCFH-DA荧光密度降低,降低的MDA水平以及增加的SOD以及T-AOC水平。然而,在血管紧张素Ⅱ干预并且给予NAC处理的乳鼠原代心室肌细胞中,抑制Mst1表达并不能进一步促进胞浆内DCFH-DA荧光降低,也不能进一步改善SOD和T-AOC水平,无法进一步降低MDA水平。8.COIP实验提示:血管紧张素Ⅱ干预引起心肌细胞中Trx与ASK1的结合力丧失,心肌细胞特异性的Mst1敲除有效逆转了血管紧张素Ⅱ干预引起的心肌细胞胞浆内Trx与ASK1结合力的丧失。心肌细胞特异性的Mst1敲除由此抑制了ASK1的活化,抑制了其下游的促凋亡通路（ASK1-JNK通路）。相比于Ang Ⅱ+Mst^fl/fl小鼠,Ang Ⅱ+Mst^Δ/Δ小鼠心肌组织中呈现出更低的JNK磷酸化水平（Thr183/Tyr185）以及更低的ASK1和p47phox表达水平。Trx与ASK1贯序免疫荧光双标实验也揭示出:同Ang Ⅱ+Mst^fl/fl小鼠相比,Ang Ⅱ+Mst^Δ/Δ小鼠心肌组织中Trx与ASK1呈现出明显的共定位现象,这也暗示心肌细胞特异性的Mst1敲除能够促进了Trx与ASK1的结合,以此对抗Ang Ⅱ诱发的Trx从ASK1中解离的效应。研究结论:1.血管紧张素Ⅱ干预引起心肌细胞胞浆内ROS的生成以及心肌细胞的凋亡,该效应可以被ROS清除剂NAC或者被心肌细胞特异性的Mst1敲除所阻断,其机制是通过抑制JNK的磷酸化和其下游信号通路的激活来实现的。但是,心肌细胞特异性的Mst1敲除不能够缓解血管紧张素Ⅱ引起Erk1/2的磷酸化,这说明心肌细胞特异性的Mst1敲除具有对MAPKs（mitogen-activated protein kinases）信号传导通路的特异性。2.心肌细胞特异性Mst1敲除缓解血管紧张素Ⅱ诱发心肌细胞凋亡的效应依赖于对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞胞浆内ROS生成的抑制。3.心肌细胞特异性Mst1敲除通过降低血管紧张素Ⅱ诱发的氧化应激来缓解血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞线粒体功能丧失。4.心肌细胞特异性Mst1敲除通过促进Trx与ASK1分子的结合来抑制血管紧张素Ⅱ诱发的ASK1分子活化,从而阻滞了血管紧张素Ⅱ诱导的ASK1-JNK促凋亡信号通路的激活,由此缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡。