研究背景本世纪以来,心血管疾病已经成为人类的第一位杀手,心肌梗死是一种常见的心血管疾病,它也是世界上致死率极高的病种之一。尽管全世界对于这种严重危害人类健康的心梗的治疗和研究十分重视,但大约6-12%的有症状的冠状动脉病变诱发的心梗病人不能及时得到血运重建(如PTCA、CABG等)挽救濒死的心肌,因此有关新的治疗方法的实验和临床研究不仅有着重要的科学意义,同时也具有重大的社会效益。心肌梗死是由多种原因导致的心肌细胞缺血缺氧,诱发心肌的炎症反应、细胞坏死、凋亡等病理改变。影响心梗预后和心功能的因素主要有心肌细胞梗死面积的大小、心肌凋亡的数量、新生血管的多少等。许多重要的因子参与了这一复杂的病理重塑过程,其中包括多聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase 1, PARP-1)。PARP-1为一类DNA修复酶,存在于除酵母外的所有真核生物细胞中,对细胞的存活和凋亡有重要的作用。正常情况下它活性很低,与损伤的DNA结合能引起PARP-1活化,进而参与DNA损伤的修复和维持遗传物质的完整性。在动脉粥样硬化发生中PARP的过度激活会引发细胞内能量消耗循环,这一过程导致细胞内NAD+和ATP的快速消耗,并最终导致内皮细胞功能障碍和坏死。PARP1的激活与临床上多种心脑血管疾病的病理过程相关,其中包括充血性心功能衰竭、高血压脑卒中、糖尿病、脑缺血,动脉粥样硬化的内皮功能异常和心梗后心衰等。而抑制PARP1表达能保护高血压、动脉硬化、脑卒中等的内皮功能以及改善心衰后的心功能。另外,诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)也是由PARP-1及NFκB共同调节的重要的炎症因子之一,而且它的过度表达导致其产物一氧化氮(NO)过量,后者能与超氧阴离子反应生成过氧化亚硝酸盐参与DNA损伤,导致细胞炎症、凋亡甚至坏死等后果。减少因iNOS过度激活产生的过氧化亚硝酸盐蓄积能减少心血管及神经变性等病变中的炎症反应,保护细胞功能。进一步的实验说明iNOS参与PARP抑制后的心、脑保护作用,且iNOS源性的NO是PARP抑制剂保护性作用的必要因子。这些分子间的相互作用应该在选择人心脑缺血疾病治疗方案中已引起足够的重视。基于以上研究,在我们的研究中提出假说：心肌缺血梗死中的DNA损伤引起PARP1的过度激活,同时iNOS等炎症因子的释放以及过氧化亚硝酸盐等的作用导致心肌细胞的坏死及凋亡的增加,心功能的恶化。而PARP1和iNOS药理学抑制剂有潜在的作用能通过有效抑制上述过程减少心肌细胞坏死和凋亡,改善心功能。因此,我们采用大鼠的心梗模型来研究PARP1和iNOS抑制剂在心梗后心功能变化中的作用,为进一步临床应用PARP1和iNOS蛋白的小分子抑制剂辅助治疗心肌梗死保护心功能提供新的理论依据。研究目的1.探讨PARP1、iNOS对大鼠心肌梗死后心脏结构及功能的影响；2.探讨PARP1、iNOS的抑制剂对大鼠心肌梗死后心功能的保护作用；3.进一步探讨PARP1、iNOS的抑制剂对心梗后心功能保护作用的可能分子机制。研究方法1.动物分组及药物处置每组10只雄性Wistar大鼠,麻醉后给予冠状动脉前降支结扎,造成心梗模型,根据分组分别给予不同的抑制剂腹腔注射。分为假手术对照组(Control)、心梗手术组(MI)、PARP抑制剂组(DPQ)、iNOS抑制剂组(1400W)共四组。2.监测各组大鼠基本指标实验过程中于造模前及处死前后各测1次心率、体重、血压。3.超声心动图评价心脏结构与功能分别在术后3天、2周和4周时麻醉大鼠,应用小动物经胸2维超声采集心功能各项指标,重点测量反应左室收缩功能的指标：左室收缩末期内径(ESD)、左室舒张末内径(EDD)、缩短分数(FS)=((EDD-ESD)/EDD)×100,取多次测量多组数据进行统计统计。4. Caspase活性检测选取凋亡相关的Caspase因子进一步评价心梗相关区域的心肌细胞凋亡,参照Caspase-3因子的活性试剂盒使用说明测定反应后吸光光密度值反应活性大小。5.活性性氧及其产物测定购买DHE染色试剂盒,按照染色步骤对实验动物取材后石蜡切片进行DHE探针标记细胞中超氧阴离子的产生。6免疫组织化学染色取心肌组织石蜡切片,分别免疫组化检测左室心肌组织PAR因子、3-硝基酪氨酸(3-NT)及vWF因子的表达,并进行综合分析。7实时定量RT-PCR基因水平检测取-80。C冻存的心肌组织,Trizol法提取心肌组织总RNA,实时定量RT-PCR技术检测各指标的表达水平。8. Western blot检测取-80。C保存的心肌组织,提取总蛋白,Western-Blot检测左室心肌组织内裂解的Caspase3片段、裂解的PARP片段以及与血管发生相关的因子vWF等的蛋白表达。9.统计学分析所用数据用SPSS16.0统计软件进行分析。数值变量资料数据以均数±标准差表示,两组间均数比较采用小样本t检验,多组间均数比较采用One-Way ANOVA方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义研究结果1.大鼠的一般情况比较整个实验中共死亡5只,最终35只大鼠完成实验。其中,Control组10只；MI组7只；MI+ DPQ组9只；MI+1400W组9只。实验开始时,各组大鼠心率、体重和血压均无差异(P>0.05)。实验结束时,各组与对照组比较,体重无明显下降(P>0.05)；心梗后心率、血压升高(P<0.05),而药物干预后的两组与对照组比较,心率、血压升高程度无统计学差异(P>0.05)。2.超声测量心脏结构和功能指标的变化MI组与对照组比较,LVIDs及LVIDd均显著扩大(P<0.05)；药物干预后的两组与MI组比较,LVIDs及LVIDd均明显减小(P<0.05)。MI组与对照组比较,FS、LVEF均不同程度降低(P<0.05)；药物干预后的两组与MI组比较,FS、LVEF均不同程度升高(P<0.05)。3. TUNEL染色观察PARP抑制剂(DPQ)和iNOS抑制剂(1400W)对梗死心肌组织细胞凋亡发生率的影响在心梗手术组,缺血心肌的细胞凋亡阳性表达数的平均光密度值(IOD)显著增高(P<0.05)；而PARP抑制剂组(DPQ)和iNOS抑制剂组(1400W)的平均光密度值(IOD)则分别减少39.71%和39.00%(P<0.05)。PARP抑制剂组(DPQ)和iNOS抑制剂组(1400W)之间没有显著差异(P>0.05).4. PARP抑制剂(DPQ)和iNOS抑制剂(1400W)对Caspase活性的影响心梗手术组caspase-3的活性显著高于对照组(P<0.05),在PARP抑制剂组(DPQ)和iNOS抑制剂组(1400W) caspase-3表达是减低的(P<0.05)。而抑制剂干预两组间的差异无统计学意义(P>0.05)。5.PARP1、iNOS抑制剂组大鼠PARP和iNOS的表达减少在心梗组DPQ和1400W的抑制率可分别达到51.14% and 51.84%(P<0.05)。免疫荧光法测定PAR的活性显示在心梗组缺血心肌的PAR的活性显著增高(P<0.05),而DPQ和1400W能够分别减低PAR的活性(P<0.05)。Western Blot检测发现心肌梗死相关组织中iNOS的表达较对照组明显升高(P<0.05),而抑制剂组均较心梗组表达下调(P<0.05)。6. PARP和iNOS抑制剂组大鼠缺血梗死心肌组织损伤性活性氧及其产物硝基酪氨酸的表达降低心梗组心肌细胞内损伤性活性氧的表达显著增加(P<0.05),而PARP和iNOS抑制剂组表达分别下降53.07%、51.43%(P<0.05)。MI组较假手术组硝基酪氨酸的表达显著增多(P<0.05), PARP抑制剂和iNOS抑制剂组的表达均明显降低(P<0.05)。7. PARP和iNOS抑制剂组大鼠梗死相关区域的新生血管vWF表达增加通过Western-blot方法检测梗死相关区域vWF蛋白表达发现,心梗组vWF蛋白的表达明显减少(P<0.05),而PARP抑制剂和iNOS抑制剂组vWF表达量明显较心梗组增加(P<0.05),提示新生血管数量的增加。研究结论1 PARP和iNOS的过度激活与心肌细胞凋亡、炎症反应密切相关,DPQ和1400W可以有效的抑制心肌缺血坏死诱发的PARP和iNOS的激活。2 PARP和iNOS抑制剂能够减少凋亡相关因子的表达,能够减少缺血部位的过氧化亚硝酸盐的产生,抑制过氧化反应,从而减少细胞凋亡,减轻炎症反应,增加新生血管,保护心脏功能。3 PARP抑制剂和iNOS抑制剂可降低心梗大鼠左室收缩末内径(LVIDs)及左室舒张末内径((LVIDd),提高缩短分数(FS),显示PARP抑制剂和iNOS抑制剂明显改善心梗大鼠心室重构,改善心脏功能。研究背景随着人口老龄化,心力衰竭(heart failure)的发病率也在日益增加,心衰是各种心脏疾病发展的最终阶段,也是心脏疾患主要的死亡原因之一。心力衰竭是由于各种原因的心肌损伤,引起心脏结构和功能的变化,最终导致心室泵血功能低下的一组症候群。引起心衰的病理生理机制十分复杂,其中包括：肾脏灌注不足和钠水潴留,室壁张力增高并血流动力学紊乱,心肌损伤致左室重构的发生,左室肥厚、室壁张力增高、心脏前后负荷增加等。尽管人们对心力衰竭的认识不断深入,但目前由于心力衰竭的患病率和死亡率居高不下,心衰的防治、评估及治疗仍是一个医学难题。多聚二磷酸腺苷核糖转移酶1(PARP-1)参与多种细胞损伤修复的生理病理过程,与心血管许多疾病的发生发展密切相关。血管诱导型一氧化氮合酶(induced Nitric Oxide Synthase, iNOS)活性增强,内皮型一氧化氮合酶活性下降、NO产生减少等是炎症或氧化刺激后血管内皮细胞功能受损的标志。临床上心力衰竭的诊断、危险分层和治疗方面有着一些专家共识及评估标准,如心脏彩超、生化检测BNP及其前体等,在心衰的诊治中起着不容忽视的作用。基于PARP-1及iNOS.的产生和生物学功能的研究基础,我们着重观察了它们与心衰患者严重程度的临床评估标准之间的相关性的关系,进一步验证其在心衰进展中的作用。研究方法1.实验对象及选择选取2011年2月至2013年8月期间山东大学第二医院心脏内科住院治疗的心功能不全患者,临床评价其心功能为NYHA Ⅱ-Ⅳ级,经心脏彩超测定左室射血分数<50%,或免疫检测血BNP>100ng/ml。对照组(n=32例)为心功能正常人群,无心功能不全症状,临床检测左室射血分数>50%且血BNP<100ng/ml。2.各指标测量标准记录所纳入患者的性别、年龄、体重、身高；测量心率、血压等；入院前服用地高辛、ACEI/ARB、β受体阻滞剂及利尿剂等口服药物情况。入院后均予以检测血常规、肝肾功能、血糖、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,行心电图、心脏彩超、胸片等相关检查,检测BNP、CRP、ESR、心肌酶等。研究对象血压测定方法为：清晨醒来后在未进行任何肢体活动前测量左上臂血压,每日测定1次,取测得收缩压(SBP)平均值作为血压指标；按照体重(kg)／身高(m)2计算体重指数(BMI)。心脏超声心动图的测定由有经验的超声医师完成,选择胸骨旁左心长轴切面测量EDD、ESD,、LVEF、LA、MRA。取连续3个心动周期所测量的各结果的平均值为研究数据。3.实验方法(1)周围静脉血血浆的分离保存：采集各研究对象清晨空腹时肘静脉血3ml,注入枸橼酸钠(EDTA)抗凝的血液收集器内,低温离心吸取上清,分装于EP管快速冻存于-80℃冰箱。(2)白细胞的分离：清晨采集静脉血于抗凝管内,人外周血白细胞分离液分离后常温离心,微量取样器吸出第二层白细胞富集层,缓冲液清洗后快冻存于-80℃保存。(3)血浆内BNP的检测步骤(酶联免疫吸附法)：血浆BNP的测定使用双抗体夹心ELISA法测定。(4)细胞中PARP-1及iNOS蛋白表达的检测采用Weston-blot法。(5)细胞中PARP-1及iNOS基因表达的检测采用RT-PCR检测。4.统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料采用平均值±标准差(x±s)表示；计量资料之间的比较采用t检验,计数资料的组间比较采用卡方检验；各变量之间的相关性采用直线相关分析(Person’s相关)；以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1.临床检测指标对比显示,与对照组相比,心功能不全患者与对照组之间体重指数(BMI)、血红蛋白、心率、血糖、血脂(TG、TC、LDL-C、HDL-C)等指标无明显统计学差异(均P>0.05),而血压(SBP)水平在心功能不全(Ⅳ级)组较对照组减低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.各组间心脏彩超及BNP检测结果与心功能不全分级的关系：与对照组相比,心功能不全患者EDD、ESD及LVEF等心脏彩超检测数值均有统计学差异,且LVEF明显降低(P<0.05); BNP浓度明显升高(P<0.05)。其中LVEF与心功能不全的相关系数R2=0.9676 (P<0.01), BNP浓度与心功能不全的相关系数R2=0.8796(P<0.01)。3.不同组PARP1及iNOS基因表达与心功能不全分级的关系：心功能不全组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)PARP1及iNOS基因表达明显升高(P<0.05); PARP1基因相对表达与心功能分级之间呈正相关(R2=0.7919, P<0.05); iNOS基因相对表达与心功能分级之间也呈正相关(R2=0.6737,P<0.05)。4.不同组白细胞内PARP1及iNOS蛋白水平与心功能不全分级的关系：与对照组相比,心功能不全组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)PARP1及iNOS蛋白相对表达明显升高(P<0.05); PARP1及iNOS相对蛋白表达与心功能分级之间呈正相关(R2=0.973,R2=0.7696,P<0.05)。5.各组PARP1及iNOS表达与LVEF的相关性分析：不管是基因还是白细胞内蛋白水平的相对表达量检测,均提示PARP1及iNOS表达均与LVEF水平呈明显负相关(P<0.05)6.各组PARP1及iNOS表达与BNP的相关性分析：不同组PARP1及iNOS相对表达量与BNP的浓度之间呈正相关(P<0.05)。结论1.无论基因水平还是蛋白质水平的结果提示：心功能不全患者血中PARP-1及iNOS表达水平较健康人群表达量均显著升高。2. PARP-1及iNOS表达水平升高与心功能不全的分级有显著的正相关性；且与BNP表达水平呈正相关,与心脏彩超测定的心功能呈负相关。3. PARP-1及iNOS的表达水平升高参与心衰的发生,并在心衰进程中扮演重要作用,有可能提示心衰的严重程度。