研究背景:活血消异方是导师治疗气滞血瘀型子宫内膜异位症的经验方。本研究从文献梳理、疗效观察、机理探讨3个方面对活血消异方组方的合理性和科学性进行了探讨,期望在现有的西药及手术治疗方法的基础上,寻求有效的预防和治疗手段,使更多内异症患者受益。研究目的:围绕研究目标,本项课题从中医文献研究、临床观察及microRNA基因表达,以及动物实验验证三个部分展开研究。1.文献研究:本论文结合古代文献分析与数据挖掘技术,分析古代妇科文献中癥瘕病治疗方药的配伍应用规律,为活血消异方治疗子宫内膜异位症治法治则、处方依据提供理论基础。2.临床研究:观察活血消异方治疗卵巢型子宫内膜异位症的临床疗效,以及治疗前后子宫内膜异位症患者血清microRNA基因表达谱的变化,以临床疗效为出发点,从基因层面探讨活血消异方治疗子宫内膜异位症可能的生物学机制。3.实验研究:通过建立实验性大鼠子宫内膜异位症模型,观察子宫内膜异位症大鼠异位病灶体积、组织学变化,血清和腹腔液相关炎性因子以及相关蛋白及基因表达的影响,探讨活血消异方治疗子宫内膜异位症可能的分子机制。研究方法:1.文献研究:检索《中华医典》收录的古代妇科医著中治疗癥瘕的方药信息,录入中医传承辅助系统,采用软件集成的改进互信息法、复杂系统熵聚类、无监督的熵层次聚类等数据挖掘方法,分析处方用药规律。2.临床研究:选取医院就诊的一定时期内,符合纳入标准,不符合排除标准的子宫内膜异位症患者作为研究对象,活血消异方加减治疗6个月,观察治疗前后痛经、月经量改变、慢性盆腔痛等临床症状、体征的改善情况,血清CA125、CA199表达变化情况以及安全性指标变化情况、不良反应情况。并于生物样本库中随机选取5例治疗有效的患者,提取治疗前、后静脉血分离的单核淋巴细胞,提取总RNA,行Real-time qPCR阵列基因芯片做miRNA检测,对差异表达的基因进行生物信息学分析。3.实验研究:选用60日龄成熟SD雌性大鼠,采用自体组织移植法造模,造模成功后随机分为活血消异方高、中、低剂量组、达菲林组、模型组、假手术组、空白对照组,共7组,每组8只,给药治疗3周。观察异位病灶体积、组织学变化情况;血清及腹腔液IL-2、IL-6、IL-1β表达变化情况;NFKB,PIK3R3,RAS基因表达情况。研究结果:(一)文献研究:1.本研究共收集治疗妇科癥瘕方剂108首,涉及中药188味,用药频次在8次以上的前15位分别是当归、桂心、赤芍、熟地、大黄、莪术、川芎、三棱、桃仁、炙甘草、干姜、延胡索、牛膝、木香、牡丹皮。其中,以养血、活血、破血、温阳、理气、通瘀药物频数较高。2.频次前10位的药物组合分别是“当归,桂心”“赤芍,当归”“川芎,当归”“延胡索,当归”“三棱,莪术”“莪术,当归”“熟地黄,当归”“川芎,桂心”、“延胡索,桂心”“赤芍,桂心”“牛膝,当归”“桃仁,当归”“莪术,青皮”,较为常见的组合是以当归为核心:与桂心组合体现了温通之法,与赤芍、熟地组合体现了养血之法,与三棱、莪术组合体现了破瘀之法,与青皮、延胡索、川芎组合体现了行气之法,与桃仁、牛膝组合体现了逐瘀之法。3.网络展示图形式发现,这些组合的配伍是以活血化瘀法为主,活血、养血、行气、温经、通瘀是治疗癥瘕较为常用的治法。(二)临床观察:1.活血消异方治疗子宫内膜异位症患者102例,疗程3～6个月,其临床总有效率为85.30%。2.不同治疗时间点卵巢囊肿缩减情况差异有统计学意义(F=17.055,p<0.001),治疗3个月和治疗6个月后卵巢囊肿均较治疗前缩小,但前3个月治疗期内囊肿消减的趋势更快。3.随治疗时间的延长,痛经程度明显缓解,痛经持续时间明显缩短,差异有统计学意义(p<0.05);治疗6个月期间,患者的中医症状均有缓解,各个疗程节点与治疗前比较,差异有统计学意义(p<0.05)。4.102例患者中月经量多患者31例,其月经积分在不同时间点测量差异有统计学差异(F=19.648,p<0.01);服药6个月经周期后较治疗前月经量明显减少;服药4个月经周期后月经量多积分不断减少至正常水平。102例患者中月经量少患者11例,服药6个月经周期后较治疗前月经量有改善,但不同时间点测量之间差异无统计学差异(F=1.084,p=0.382)。5.治疗6个月后CA125较治疗前总体趋势降低(F=7.101,P=0.024);CA199较治疗前总体趋势降低(F=10.008,P=0.008),差异有统计学意义(p<0.05)。6.在数据完整的78例患者中,治疗前血清TNF-α异常的有2例(2.5%),治疗6个月后后血清TNF-α异常1例,差异无统计学意义(p>0.05)。7.本研究中纳入的患者,在服药3个月经周期和服药6个月经周期肝肾功指标均未见异常,差异无统计学意义(p>0.05),心电图,血尿常规均未见明显异常。(三)microRNA表达谱芯片表达:Real-time qPCR阵列基因芯片检测,共筛选出5个qRT-PCR验证的有差异表达的 microRNA,其中上调的基因表达有 miR-202-3p,miR-9-5p,miR-155-5p;下调的基因表达有miR-216a-5p,miR-518a-5p。涉及的通路集中在催乳素信号通路,Ras信号通路,Rap1信号通路,Hippo信号通路,雌激素信号通路,神经营养因子信号通路,ErbB信号通路,甲状腺激素信号通路,磷脂酰肌醇信号系统,MAPK信号通路,TGF-β信号通路,FoxO信号通路,癌症途径等信号通路上。这些富集的通路主要与细胞黏附、迁移以及部分细胞凋亡功能相关。(四)动物实验:1.子宫内膜异位症模型大鼠在给药3周后,中药高剂量、中剂量组和达菲林组异位病灶体积与给药前相比明显变小或者消失,差异有统计学意义(p<0.05);2.HE染色后,采用半定量组织学分类方法确定子宫内膜异位症评分发现:达菲林组和中药高剂量组的子宫内膜异位症评分明显低于模型组,差异有统计学意义(p<0.05)。中药低剂量组和中药中剂量组在降低子宫内膜异位症评分方面优势不明显(p>0.05)。3.Real-time PCR对目的基因检测后发现:正常组与模型组相比,模型组的NFKB,PIK3R3,RAS基因表达量显著增高,差异有显著性(正常组2-ΔΔAt>1);治疗后,中药高剂量组与模型组相比,NFKB,PIK3R3,RAS基因表达量显著降调,差异有显著性(2-ΔΔCt>1);中药中剂量组与模型组相比,NFKB,PIK3R3基因表达量显著降调,差异有显著性(2-AΔCt>1);RAS基因表达量降调,但差异无显著性(2-AΔCt<1);治疗后,中药低剂量组与模型组相比,NFKB,PIK3R3,RAS基因表达量显著降调,但差异无显著性(2-ΔΔCt<1)。4.采用双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测相关细胞因子浓度:模型组异位病灶血清和腹腔液IL-2、IL-6、IL-1β的浓度显著高于正常组、假手术组和治疗组(p<0.05)。经活血消异方高、中剂量组和达菲林组治疗的子宫内膜异位症大鼠血清和腹腔液中IL-2、IL-6、IL-1β的浓度明显降低(p<0.05)。研究结论:活血消异方是基于古代文献关于妇科癥瘕类疾病的认识,遵循中医立法原则和处方规律,在继承和发展名老中医经验的基础上制订的治疗子宫内膜异位症的有效方剂。临床观察表明,活血消异方治疗子宫内膜异位症在消减包块、缓解痛经、改善月经、抑制病情方面具有良好的疗效,且安全性好,无明显不良反应。动物实验研究表明活血消异方抑制异位病灶生长可能的分子机制是:上调miR-9-5p 表达,下调其靶基因 NFKB,PIK3R3,通过“Ras-PIK3R3/Akt”级联信号通路抑制异位细胞生长、增殖和转移;且中药的疗效存在剂量依赖关系,中药高剂量组明显优于中、低剂量组。此外,活血药物还通过降低细胞因子IL-2、IL-6、IL-1β的水平,调节机体整体免疫内环境、改善炎性反应状态,起到多靶点治疗的作用。