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研究目的:1、建立可靠的缺血预处理(IPC)大鼠模型,用于后续探讨IPC诱导缺血耐受的相关机制;2、分别观察IPC后大鼠脑组织和外周血单个核细胞(PBMCs)中PPARγ及其靶基因LPL、CD36、CAT、Bcl-2等随时间的表达变化,以及皮层中PPARγ的细胞定位,初步探讨这些变化的影响和意义;3、观察脑缺血后不同再灌注时间点(1d、3d、7d、12d)IPC大鼠脑组织和PBMCs中PPARγ、NFκB的表达及活性改变,及炎症指标COX-2、3NT等的表达变化,评估IPC对后续脑缺血再灌注损伤的影响,并对其相关机制进行初步探讨。实验方法:1、选取夹闭双侧颈总动脉(BCCAO)的方法建立大鼠IPC模型,通过行为学评分、TTC染色、脑组织冰冻切片的Hoechst染色、免疫荧光法检测HSP70表达来评估该IPC模型的可靠性。2、将SD大鼠随机分为IPC模型组(IPC组)、假手术组(Sham组),根据术后1d、3d、7d、12d四个时间点,将各组随机分为4个亚组:(1)采用Western blot法检测各组皮层组织和PBMCs中PPARγ及其靶基因LPL、CD36、CAT、Bcl-2总蛋白的表达,以观察PPARγ表达及活性随时间的变化;(2)采用免疫荧光法观察脑组织中PPARγ、LPL的细胞定位。3、将SD大鼠随机分为IPC后脑缺血再灌注损伤组(IPC-I/R组)、单纯脑缺血再灌注损伤组(I/R组)、正常对照组(Contrl组)三组,根据不同再灌注时间1d、3d、7d、12d,将IPC-I/R组、I/R组随机分为4个亚组:(1)采用行为学评分及TTC染色对IPC-I/R-3d亚组与I/R-3d亚组的脑组织损伤进行评价,观察IPC是否对后续I/R产生保护作用;(2)采用Western blot法检测各组脑组织PPARγ总蛋白表达,免疫荧光法检测皮层神经元中PPARγ的亚细胞定位,观察并比较IPC-I/R组和I/R组PPARγ表达及核移位(代表其活性)随再灌注时间的变化;(3)采用Western blot法检测各组皮层NF-κB、COX-2的总蛋白表达,免疫荧光法检测脑组织神经元中NF-κB的亚细胞定位及3-NT的表达,观察IPC是否可减轻后续I/R脑组织的炎症反应;(4)采用Western blot法检测各组PBMCs中PPARγ及其靶基因CD36的总蛋白表达,观察并比较IPC-I/R组和I/R组PBMCs中PPARγ表达及活性随再灌注时间的变化;(5)采用Western blot法检测各组PBMCs中NF-κB总蛋白的表达,观察IPC是否可减轻后续I/R外周的炎症反应。实验结果:1、模型评价:对BCCAO法制作的IPC大鼠模型进行行为学评分未见神经功能缺损,TTC染色无梗死灶,Hoechst染色未见细胞凋亡,HSP70表达明显增加(P<0.001,差异具有统计学意义),表明该方法制作的IPC模型稳定、可靠。2、IPC大鼠脑组织、PBMCs中PPARγ的表达变化:(1)Western blot检测:与Sham组相比,IPC大鼠脑组织和PBMCs中PPARγ总蛋白表达增加(均P<0.05,差异具有统计学意义),且两者随时间的表达变化一致,均表现为先增高后下降的趋势,于IPC后第3天到达高峰(与IPC-1d、IPC-7d、IPC-12d组相比,IPC-3d组明显增加,均P<0.05,差异具有统计学意义),随后下降;PPARγ靶基因LPL、CAT、Bcl-2、CD36的表达变化与PPARγ一致,均于IPC后第3天到达高峰,随后下降;(2)免疫荧光检测:IPC大鼠脑组织中PPARγ的表达主要位于神经元,小胶质细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞中均未见明显表达;与Sham组相比,IPC大鼠脑组织神经元中PPARγ靶基因LPL表达明显增加(P<0.05,差异具有统计学意义)。3、IPC对后续I/R的影响及相关机制探讨:(1)脑损伤评价:与同一再灌注时间点的I/R亚组相比,IPC-I/R各亚组的神经功能缺损减轻(均P<0.05,差异具有统计学意义);与I/R-3d亚组相比,IPC-I/R-3d亚组脑梗死体积明显缩小(P<0.05,差异具有统计学意义)。(2)Western blot检测:1)脑组织PPARγ的表达:IPC-I/R组、I/R组PPARγ的表达均随再灌注时间呈先增高后下降趋势,均于再灌注3d达到高峰,随后下降;与同一再灌注时间点的I/R组相比,IPC-I/R组PPARγ的表达再灌注1d增高(P<0.05),再灌注3d减低(P<0.05),再灌注7d、12d略有增高(均P<0.05),差异具有统计学意义,即与I/R组相比,IPC-I/R组PPARγ表达基础值较高,峰值略低,但持续时间较长;2)脑组织NF-κB的表达:IPC-I/R组NF-κB表达在再灌注1d最高,随后逐渐下降,再灌注7d、12d恢复至正常水平;I/R组NF-κB表达呈先增高后下降趋势,于再灌注3d达到高峰;在同一再灌注时间点,IPC-I/R组NF-κB的表达低于I/R组(均P<0.05),差异具有统计学意义;3)脑组织COX-2的表达:IPC-I/R组与I/R组的表达均呈先增高后下降趋势,均于再灌注3d到达高峰,随后下降;在同一再灌注时间点,IPC-I/R组COX-2的表达低于I/R组(均P<0.05),差异具有统计学意义,提示IPC可减轻后续I/R诱导的炎症反应;4)PBMCs中PPARγ表达:IPC-I/R组与I/R组的表达均呈先增高后下降趋势,均于再灌注3d到达高峰,随后下降;与相同再灌注时间点的I/R组相比,IPC-I/R-1d亚组PPARγ表达无统计学差异(P>0.05),IPC-I/R-3d亚组PPARγ表达减少(P<0.05),IPC-I/R-7d、IPC-I/R-12d亚组表达增加(均P<0.05),差异具有统计学意义。5)PBMCs中CD36表达:IPC-I/R组与I/R组的表达均呈先增高后下降趋势,均于再灌注3d到达高峰,随后下降;与相同再灌注时间点的I/R组相比,IPC-I/R组CD36的表达均增加(均P<0.05),差异具有统计学意义。提示IPC-I/R组PPARγ活性强于I/R组。6)PBMCs中NF-κB表达:IPC-I/R组NF-κB表达随再灌注时间无明显变化趋势,I/R组NF-κB表达呈先增高后下降趋势,在再灌注3d到达高峰;在同一再灌注时间点,IPC-I/R组NF-κB的表达低于I/R组(均P<0.05),差异具有统计学意义,提示IPC-I/R组的外周炎症反应弱于I/R组。(2)免疫荧光检测:1)脑组织PPARγ:IPC-I/R组PPARγ表达多位于神经元胞核内,I/R组PPARγ表达多位于神经元胞浆内;2)脑组织NF-κB:IPC-I/R组NF-κB表达多位于神经元胞浆内,I/R组NF-κB表达多位于神经元胞核内;3)脑组织3-NT:在同一再灌注时间点,IPC-I/R组3-NT表达少于I/R组(均P<0.05),差异具有统计学意义。实验 结论:1、IPC后脑组织和PBMCs中PPARγ的表达和活性增加,且脑组织的PPARγ主要分布于神经元。IPC可能通过上调皮层神经元中PPARγ的表达和活性,提高其抗炎、抗氧化应激、抗凋亡的耐受能力,产生直接的神经保护作用;IPC也可能通过调节外周免疫细胞,产生系统性的保护作用,间接保护神经元。2、IPC后脑组织与PBMCs中PPARγ的表达和活性随时间的变化具有一致性,PPARγ或可作为评估是否具有IPC保护作用的生物标志物。3、IPC可同时减轻中枢和外周炎症反应,对后续脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其作用机制可能与IPC上调脑组织和PBMCs中PPARγ的表达和活性,提高抗炎、抗氧化应激、抗凋亡的能力有关。