第一章 VB1对肝癌Hep G2细胞生长及其诱导血管生成的影响　　目的:检定纯化牡荆脂素化合物1(purified vitexin compound1，VB1)对人肝癌Hep G2细胞生长及其诱导血管生成的抑制作用。　　方法:体外培养人肝癌细胞系Hep3B、Huh-7和Hep G2与永生化人胚肝细胞系L-02以及人脐静脉内皮细胞系HUVE-12。与常规化疗药物氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)对照，MTT比色法检测VB1对不同肝癌细胞系增殖活性的影响。平皿集落形成法和软琼脂培养集落形成法检测不同浓度VB1对Hep G2细胞生长的影响。流式细胞术检测VB1对细胞周期进程的影响。内皮管结构形成试验评价VB1对肝癌细胞条件培养基诱导血管生成的影响。　　结果:1.VB1以浓度依赖方式抑制人肝癌细胞增殖，不同细胞系，其敏感性不同;Hep G2细胞系较敏感，Hep3B细胞系中等敏感，对其相对不敏感细胞系为Huh-7细胞;VB1对永生化人胚肝L-02细胞作用微弱。在相同药物浓度下，VB1抑制肝癌细胞增殖活性作用优于常规化疗药物5-FU(p＜0.05)，并其选择性较高。　　2.平皿集落形成、软琼脂培养集落形成法结果显示，5.0、10.0μM VB1处理的细胞集落数均显著低于对照组(p＜0.05)，随着VB1浓度的增加，Hep G2细胞集落数逐渐减少，VB1对Hep G2细胞生长抑制作用优于相同浓度的5-FU。说明VB1对细胞的锚定依赖性生长和锚定非依赖性生长能力有显著抑制作用，呈浓度依赖性。　　3.流式细胞术结果显示不同浓度VB1处理Hep G2细胞，处于细胞周期G1期的细胞比率分别为49.2％、53.2％、63.4％，显著高于对照组的42.2％，差异有统计学意义(p＜0.05)。随着VB1浓度增加，Hep G2细胞周期G1期的细胞由对照组的42.2％升高为63.4％，而S期细胞百分率减少，由对照组的46％下降至24.3％。　　4.内皮管结构形成试验结果显示不同浓度VB1孵育Hep G2细胞的条件培养基抑制人脐静脉内皮细胞系HUVE-12细胞管结构形成能力，与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.05)，随着VB1浓度的增加，其抑制作用增强。　　结论:纯化牡荆脂素化合物1(VB1)具有抑制肝细胞癌Hep G2细胞增殖、生长和诱导血管生成作用。　　第二章 VB1对肝癌Hep G2细胞凋亡的影响　　目的:检测VB1诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡作用。　　方法:碘化丙啶染色流式细胞术定量检测不同浓度VB1作用Hep G2细胞的凋亡率;酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞组蛋白/DNA碎片水平;DNA琼脂糖凝胶电泳法观察细胞DNA断裂。Caspase活性检测试剂盒测定细胞caspase-3/8/9活性。　　结果:1.VB1增高Hep G2细胞凋亡率，表现为sub-G1期细胞百分率由2.4％增至30.2％，并呈剂量依赖性，其体外诱导细胞凋亡作用优于常规化疗药物5-FU(P＜0.05)。　　2.ELISA检测结果表明，不同浓度VB1或5-FU(10.0μM)作用24 h，HepG2细胞内组蛋白/DNA碎片水平显著高于溶媒对照组(P＜0.05)，且5.0μM和10.0μM的VB1处理的细胞组蛋白/DNA碎片水平显著高于2.5μM VB1处理组(P＜0.05); VB1(10.0μM)诱导细胞组蛋白/DNA碎片水平显著高于相同浓度5-FU(P＜0.05)。　　3.DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示VB1处理诱导DNA核小体间断裂，呈典型的细胞凋亡特征性“梯形”条带图谱，然而，溶媒对照组未见典型的“梯形”条带。　　4.VB1以剂量依赖方式激活Hep G2细胞caspase-3/8/9，通用型caspase抑制剂zVAD-fmk预处理后caspase-3、caspase-8和caspase-9的活化片段明显减少(p＜0.05)，caspase-3抑制剂zDEVD-fmk、caspase-8抑制剂zIETD-fmk和caspase-9抑制剂zLEHD-fmk预处理可减弱VB1激活caspase-3、caspase-8和caspase-9的作用(p＜0.05)。　　结论:纯化牡荆脂素化合物1(VB1)以浓度依赖方式诱导人肝细胞癌Hep G2细胞凋亡，并依赖于caspase活化级联反应。　　第三章 VB1诱导肝癌Hep G2细胞生长抑制及凋亡作用的机制研究　　目的:探讨VB1诱导人肝癌Hep G2细胞生长及其血管生成抑制和促进细胞凋亡作用分子机制。　　方法:Western blot检测不同浓度VB1对Hep G2细胞PI3K/AKT及MAPK信号分子蛋白表达以及磷酸化水平影响;同时，检测FOXO3a总蛋白及相应磷酸化蛋白的表达水平;最后，分析FOXO3a下游细胞周期调节蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平改变。Western blot和ELISA检测不同浓度VB1对Hep G2细胞VEGF合成和分泌的影响。采用药理学特异性阻断剂(MEK抑制剂PD98059)和小干扰RNA(AKT特异性siRNA和FOXO3a特异性siRNA)抑制相应靶基因表达或活性以研究VB1调控肝癌细胞增殖、凋亡信号传导作用的分子机制。　　结果:1.Western blot结果显示，随着VB1浓度的升高，Hep G2细胞RAS、p-PI3K、p-AKT、p-ERK蛋白的表达逐渐减弱，p-JNK蛋白表达逐渐增强，但不影响其总蛋白的表达水平。　　2.随着VB1作用浓度的升高，Hep G2细胞FoxO3a磷酸化水平依次降低，FOXO3a下游靶基因产物p21、p27、TRAIL、DR4、DR5、Bim蛋白表达水平逐渐上调，Cyclin D1、Survivn蛋白表达逐渐下调。　　3.与溶媒对照组细胞相比，不同浓度VB1可明显抑制Hep G2细胞VEGF蛋白表达及细胞培养液中VEGF的分泌(P＜0.05)。　　4.AKT特异性siRNA、MEK抑制剂PD98059增强VB1抑制Hep G2细胞FOXO3a磷酸化的作用，FOXO3a特异性siRNA对p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2表达无影响。　　5.AKT特异性siRNA、MEK抑制剂PD98059增强VB1抑制Hep G2细胞增殖和诱导凋亡的效应，而FOXO3a特异性siRNA能有效拮抗VB1抑制Hep G2细胞增殖和诱导凋亡的效应(P＜0.05)。　　结论: PI3K/AKT和MAPK信号通路阻断导致FOXO3a转录因子活化参与VB1抑制肝细胞癌Hep G2细胞生长及其诱导细胞凋亡。