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纤维素是自然界里分布广泛、含量丰富的一种生物能源,其分子结构复杂很难被自然分解。利用微生物纤维素酶水解纤维素后再利用,对废物纤维素是一种有效,环保的解决方式。纤维素酶降解纤维素的过程广泛被认可的是外切葡聚糖酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄苷酶(BG)三种组分之间的协同作用,外切纤维素酶起到非常重要的作用,粗糙脉孢菌是能产纤维素酶的一种重要模式微生物,存在十几种CBH基因,这些基因在纤维素降解过程中起到不同的作用,同时它们之间存在着相互协同的作用。本实验通过构建三种CBH基因缺失突变菌株和三种基因的过表达菌株了解三种基因在纤维素降解过程中的作用及几种基因之间的相互作用关系。本实验在已有粗糙脉孢菌cbh-1(NCU07340)、cbh-2(NCU09680)、gh6-3(NCU07190)三种基因缺失突变菌株的基础上,采用孢子杂交的方法成功构建得到它们的双基因和三基因缺失突变菌株;根据Neurospora crassa Database设计引物对三个基因进行克隆,并与qa-5myc.6His载体进行连接,成功构建载体qa-5myc.6His-NCU07340、qa-5myc.6His-NCU09680、qa-5myc.6His-NCU07190。通过电转化方法将载体转入组氨酸缺陷型菌株4200his~-中,Western杂交检验,得到cbh-1、cbh-2、gh6-3过表达克隆子,其表达蛋白大小分别约为90KDa、70KDa、65KDa。进一步对获得的基因缺失菌株和基因过表达菌株的生长表型进行观察,发现cbh-2基因缺失会使菌丝的生长速度变慢,菌丝变细,分枝变多,这一点在cbh-2单基因缺失、cbh-1与cbh-2双基因、cbh-2与gh6-3双基因及三基因缺失菌株都有发现。它们的产孢形态也发生了不同程度的变化,基因缺失造成孢子数量减少。这些观察结果说明CBH基因缺失对菌株的生长发育存在着不同程度的影响。研究表明3种CBH基因缺失对CBH酶活性均有不同程度的影响。cbh-2基因缺失后CBH酶活性降低最显著,约降低59%,cbh-2与cbh-1,cbh-2与gh6-3双缺失和3基因缺失酶活变化与cbh-2单基因缺失相似;cbh-1基因缺失造成CBH酶活性降低约48%,gh6-3基因缺失降低约22%。但是cbh-1与gh6-3双基因缺失的酶活要高于cbh-1和gh6-3单基因缺失,纤维素酶系统组成和表达复杂性可能解释这一现象,但还需进一步从转录水平进行研究。对另外两种纤维素酶活检测结果表明,CBH基因缺失会降低内切纤维素酶活性,但β-葡萄糖苷酶活性未发现明显变化,CBH过表达对内切纤维素酶活性及β-葡萄糖苷酶活性均无明显影响。几种过表达菌株在不同碳源培养基中CBH酶活不同,天然纤维素诱导产酶效果更好,与野生型相比几种过表达菌株CBH酶活有不同程度的提高。