背景:膜性肾病（MN）是一种肾小球疾病,可发生于所有年龄段。在成人中,它是肾病综合征的最常见原因。在过去十年中,对于MN发病机制的理解和治疗管理得到了迅速发展。MN具有一定异质性:约80%的病例在没有明确病因的情况下发生,约20%与感染（乙肝）、红斑狼疮、癌症或药物中毒等临床疾病相关。2009年,通过在70%到75%的特发性膜性肾病（IMN）的病例中鉴定出肾小球沉积的Ig G为足细胞受体:磷脂酶A2受体（PLA2R）,IMN的自身免疫性质得到了明确描述。抗PLA2R自身抗体,主要为Ig G4亚类,其在血清中的定量目前已用于帮助诊断和监测对免疫抑制治疗的反应。尽管如此,仍有许多与自身免疫反应的发展、Ig G亚类和抗原性表位的作用以及足细胞损伤的途径有关的问题未被解决,PLA2R相关IMN的发病机制需要进一步挖掘和探究。生物信息学在医学中的飞速发展使得我们可以通过对疾病基因组学数据解读来分析其内在的发病机制以及为其临床治疗提供新的指导。本研究通过生物信息学对PLA2R相关IMN的发病机制进行深入挖掘。目的:利用GEO数据库筛选PLA2R相关IMN发病机制的关键基因和通路。在临床组织样本中验证核心基因的表达。建立抗fx1a抗血清诱导的大鼠被动PHN模型,并在该模型基础上对筛选出的关键基因及通路进行调控并检测其功能,以期为IMN提供新的治疗靶点。方法:1.从GEO数据库下载IMN肾穿刺样本的芯片数据集GSE115857,其中包含11个来自IMN患者的肾活检组织,7个来自活体捐赠者的肾活检组织。利用R软件（Version 3.6.2）中的limma软件包对IMN组和活体捐赠组进行差异表达分析。获得差异表达基因（DEGs）后使用DAVID在线数据库和Cytoscape软件的Clue Go插件对其进行GO和KEGG通路富集分析。通过STRING数据库构建DEGs对应的蛋白的蛋白质-蛋白质互作网络（PPI）,并通过Cytoscape软件进行可视化操作。利用Cytohubba插件和MCODE插件鉴定核心基因（hub gene）和热点模块,并通过插件Clue Go对鉴定出的模块中的DEGs进行富集分析。再利用GSEA软件对IMN组与活体捐赠组样本的全部基因表达谱进行通路富集分析,以筛选与IMN发病机制相关的重要通路。2.收集在南昌大学第二附属医院肾活检诊断为特发性MN的8个样本和2个正常肾活检样本,所有因药物、恶性肿瘤、感染或自身免疫性疾病而疑似继发病例均被排除。患者肾活检病理结果确定后采集该患者血液并分离出血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗PLA2R和THSD7A浓度。用免疫组织化学法验证IMN肾活检样本中核心基因VEGFA和关键通路基因PI3K和AKT的表达差异。3.构建抗fx1a抗血清诱导的大鼠PHN模型。采用CCK8法评估人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）在不同浓度、不同时间的贝伐单抗（BV）刺激下的存活状态,筛选出最佳刺激浓度和时间。用适宜浓度BV刺激PHN模型大鼠,并对大鼠肾组织切片进行免疫组织化学和免疫荧光染色,检测VEGFA、PIK3、AKT的表达情况。收集各组大鼠24h尿液分析蛋白含量。电镜下观察各组大鼠肾组织中肾小球的结构变化。结果:1.生物信息学分析IMN的关键基因、模块以及富集通路。（1）通过limma软件包筛选出与PLA2R相关IMN差异表达基因1422个,其中952个上调基因,470个下调基因。（2）在DAVID数据库从生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）方面进行DEGs的GO分析,结果如下:前15个BP富集在信号传导、RNA聚合酶II启动子转录调控、细胞黏附、细胞增殖的负调控、对药物的反应、细胞外基质组织、细胞迁移、I-k B激酶/NF-k B信号转导的正向调节、对机械刺激的反应、对细胞因子的反应、对有机环化合物的反应、细胞对成纤维细胞生长因子刺激的反应、核转录m RNA多聚（A）尾短缩、核转录RNA分解代谢过程正调控和脱腺苷化依赖的衰减、正向趋化的正调控;前15个CC富集在胞质、核质、膜、细胞外间隙、线粒体、细胞内、内质网、局灶粘连、突触后密集区、核膜、SNARE复合体、细胞突出、吞噬囊泡、CCR4-NOT复合体和肥大细胞颗粒;前15个MF富集在蛋白结合、锌离子结合、转录因子活性和特定序列DNA结合、相同蛋白结合、序列特异性DNA结合、转录因子结合、β-连环蛋白结合、类固醇激素受体活性、ATP酶活性结合于物质的跨膜运动、RNA聚合酶II激活转录因子结合、转录因子活性和RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性结合、突触融合蛋白-1结合、神经营养因子TRKA受体结合、棕榈酰辅酶a水解酶活性、阴离子跨膜转运ATP酶活性。（3）KEGG通路分析:前15位聚集在PI3K-Akt信号通路、HTLV-Ⅰ感染、细胞粘附分子（CAMs）、TNF信号通路、泛素介导的蛋白水解、破骨细胞分化、类风湿关节炎、AMPK信号通路、沙门氏菌感染、南美锥虫病、NF-k B信号通路、ECM受体相互作用、ABC转运蛋白、安非他明成瘾、囊泡运输中的SNARE相互作用。（4）利用STRING构建的PPI网络:共有1199个节点和5490条边,其中上调基因760个,下调基因350个。（5）根据CytoHubba中的五种分类方法筛选出前30个hub基因,通过韦恩图重叠这30个基因,得到3个中心基因:1个上调基因VEGFA、2个下调基因JUN和FOS。通过MCODE插件获得6个热点模块。（6）GSEA分析:通过归一化富集评分（NES）发现数据集的IMN组最显著富集通路为血管生成,对富集贡献分数最大的13个核心基因包括PTK2、SLCO2A1、COL3A1、FSTL1、CCND2、SERPINA5、VEGFA、VAV2、OLR1、APP、POSTN、VCAN和NRP1。2.对核心基因（VEGFA）和关键通路基因（PI3K、AKT）的临床组织验证以及体内研究验证。（1）ELISA检测收集的8例IMN患者血清抗PLA2R水平均显著升高。免疫组化结果显示,与对照组相比,IMN患者肾组织VEGFA、PI3K、AKT的表达量升高（P＜0.05）。（2）在HUVEC细胞中,贝伐单抗添加的浓度越高,细胞生存能力越低;孵育时间越长,细胞活力越低。（3）成功构建PHN大鼠模型,选用2mg/kg贝伐单抗刺激PHN模型组大鼠。免疫荧光实验结果显示,与模型组相比,VEGFA抑制剂（BV）刺激后VEGFA的表达显著下降。免疫组织化学结果显示,与对照组相比,模型组VEGFA、PI3K和AKT表达明显上调,而BV刺激后,VEGFA、PI3K和AKT表达下调。电镜观察结果表明,BV刺激后肾小球基底膜和肾小球内皮细胞形态较模型组有所改善。结论:1.基于生物信息学分析,确定了1422个基因为DEGs,3个中心基因（1个上调基因VEGFA,2个下调基因JUN和FOS）,以及6个从PPI网络中选择的重要模块。部分揭示了IMN的分子机制,可能用于开发治疗IMN的新靶点。2.VEGFA、PI3K和AKT在IMN肾组织中表达升高。3.VEGFA抑制剂贝伐单抗可以通过PI3K/AKT信号通路降低PHN大鼠的蛋白尿和维持肾小球内皮细胞的完整性。