【摘 要】
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Ⅰ型鸭病毒性肝炎是由Ⅰ型鸭肝炎病毒引起的雏鸭高度致死性传染病。在我国爆发的鸭肝炎主要由DHV-Ⅰ引起,给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。但是有关DHV-Ⅰ病毒蛋白功能的研
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Ⅰ型鸭病毒性肝炎是由Ⅰ型鸭肝炎病毒引起的雏鸭高度致死性传染病。在我国爆发的鸭肝炎主要由DHV-Ⅰ引起,给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。但是有关DHV-Ⅰ病毒蛋白功能的研究报道较少,其中大部分还只是对其基因组结构和蛋白组成的预测,并且还有分歧。由于分子生物学相关研究进展非常缓慢,使得对该病的诊断和防治比较落后,本实验通过对DHV-ⅠQV株结构蛋白的VP1、VP0和VP3基因克隆、真核表达和免疫活性检测的研究,为DHV-Ⅰ的诊断、分子流行病学研究和新型疫苗的研制提供科学依据。
本实验根据GenBank上已发表的DHV-Ⅰ基因序列设计了三对特异性引物,以QV株为模板,采用RT-PCR方法扩增了QV株VP1、VP0和VP3编码基因,将其分别克隆到pFastBacHTB载体上,然后转化大肠杆菌Top10感受态细胞,经BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定及PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒并送测序;随后将阳性的重组质粒分别转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得阳性重组转座子。在脂质体介导下将获得的重组转座子分别转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染的细胞收集,超声波裂解后,进行SDS-PAGE和Western-blot免疫学活性分析。
实验表明,成功地克隆了DHV-Ⅰ(QV株)结构蛋白VP1、VP0和VP3基因。构建了重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-VP1、rBacmid-VP0和rBacmid-VP3。转染sf9细胞后,SDS-PAGE和Western-blot分析表明,成功的表达了VP1、VP0和VP3蛋白,大小分别为36 KD,38 KD和30 KD左右。三种蛋白均能与DHV-Ⅰ全病毒免疫阳性血清发生特异性免疫反应,说明所表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。这为以真核表达的VP1、VP0和VP3蛋白为抗原的基因工程疫苗的研制奠定了基础。
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