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背景 败血症及败血症休克都是临床上常见的急危重症，死亡率高，至今临床上仍缺乏疗效高、副作用小的方法。细菌感染是败血症休克最常见的病因，细菌的产物，如内毒素，外毒素和细菌外壁成分—脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可直接或间接地刺激单核细胞、多形核中性粒白细胞或内皮细胞等靶细胞启动炎症进程，产生促炎细胞因子(proinflammtory cytokine)。 败血症休克一般伴有严重的心血管功能障碍，并最终发展成为全身低血压及心肌收缩抑制的不可逆性。给实验动物注射纯化的LPS来模拟败血症休克是近年来国际上比较通用而有效的手段，LPS进入体内后能刺激多种促炎细胞因子及血管活性物质的过量表达，影响心血管功能。为了阐明LPS心血管效应的机理，过去有很多研究往往集中在一级介质——促炎细胞因子上，但是大量实验和临床试验表明，抑制促炎细胞因子的表达并不能改善LPS引发的心血管功能的抑制效应。因此，现在越来越多的研究者开始关注LPS及促炎细胞因子刺激产生的二级介质。 一氧化氮(nitric oxide，NO)和内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是两个重要的血管活性物质，在生理条件下，两者相互拮抗共同调控心血管功能。很多证据表明，LPS刺激浙江大学硕士学位论文引起这两种物质的过量表达，从而使两者间的平衡打破，对心血管功能紊乱产生重要影响。对于NO和ET-1在其中发挥的具体作用至今没有得到统一认识。目的 腹腔注射LPs建立败血症休克模型，应用离体血管环、Langendorff离体灌流心脏及单个心室肌细胞模型来研究LPS对大鼠主动脉环反应性、冠状动脉阻力、心肌收缩力、细胞内钙瞬变及线粒体功能的影响，初步探讨LPS引发的心血管作用及相关机制，重点在于阐明NO、ET-1在其中发挥的具体作用。方法1.败血症休克动物模型的建立雄性sD大鼠腹腔注射LPs 10mg/kg，4小时后处死。2.血清亚硝酸盐/硝酸盐(NOZ祝03一)测定制备血清样本，采用氯化钒还原法检测血清中N仇一加仇一含量以反应NO含量的改变。3.血浆ET-1含量的放射免疫分析制备血浆样本，采用‘251一ET-1均相竞争法测定血浆中的ET-1含量。4.离体血管环灌流实验采用organ bath离体血管环灌流装置，主动脉环稳定于改良K-H液中，通过PowerLab信号采集处理系统(AD Ins仃uments，澳大利亚)来记录血管收缩反应曲线。浙江大学硕士学位论文5.离体心脏冠脉阻力、左室功能评价采用Langendorff恒流灌注技术，通过MedLab信号采集处理系统(南京美易)来记录心肌收缩功能指标及冠脉灌注压(c~arype而sion Pressure，CPP)的改变。根据cPP的改变来反应冠脉收缩力的改变6.心室肌细胞酶解分离I型胶原酶酶解分离大鼠心室肌细胞。7.咖啡因诱导的心肌细胞内钙瞬态分析用细胞内双波长钙荧光系统(T.LLL.，德国)检测细胞内游离钙离子浓度，以Fura一2/AM为钙指示剂。8.心室肌细胞肌浆网c扩气ATpase活性检测制备离体大鼠心室肌细胞肌浆网，采用无机磷比色法测定ca2+确Tpase活性。肌浆网蛋白含量的测定采用考马斯亮兰蛋白测定法。9.心肌细胞线粒体的提取和线粒体丙二醛(MDA)含量测定分离心肌线粒体，采用硫代巴比妥酸法，根据试剂盒说明书操作，测定样本中的MDA含量。结果第一部分LPS对大鼠主动脉和冠脉反应性的影响及相关机制1 .LPS处理组血清NOZ加03一水平与对照相比增加了近20倍。2.LPS处理的大鼠血浆ET-1含量显著增加(P<0.05)。浙江大学硕士学位论文3 .LPS对大鼠离体主动脉环对苯肾上腺素(phe咧ePhrine，PE)收缩反应的影响(1)LPS处理组主动脉环对PE的浓度一收缩反应曲线明显低于对照组;(2) iNOS特异性抑制剂AMG孵育LPs处理过的主动脉环1小时，对主动脉低反应的抑制作用呈浓度依赖性，roo林M和lmM的AMG能完全取消LPS引起的主动脉环的低反应性，10“M的AMG则没有这个效果。4.LPS对离体心脏冠脉收缩力的影响(1) LPs处理的大鼠心脏其cPP显著升高;(2)用AMG(l0omg/kg，i.P.)单独预处理并不能缓解LPs引起的CPP的升高;(3)用ET^特异性阻断剂BQ一123(lm叭g，i:P)预处理后，LPS诱导的CPP升高效应被减弱;(4) BQ一123和AMG联合预处理后的效果与单独应用BQ一123预处理后的结果相似。第二部分LPS对大鼠心肌收缩力的作用及相关机制1 .LPS对左室心肌收缩功能的影响(1) LPS显著降低了左室发展压和心率的乘积(LVDPxHR)、左心室内压上升和下降速度峰值(士dp/dtmax);(2) AMG单独预处理只能部分逆转LPS诱导的心脏收缩功能下降;(3) BQ一123单独预处理部分逆转LPS诱导的心脏收缩功能下降;(4) BQ一123联合AMG则可显著抑制LPS引起的心脏负性肌力作用。2.LPS对心肌细胞内钙稳态的影响(1) LPS处理后，与对照组相比，心肌细胞对咖啡因诱导的内钙瞬变幅度显著降低。(P<0.01)。(2) LPs处理后，与对照组相比，其心肌细胞肌浆网c扩气ATPase活性受到显著抑制(P<o，01);单独以AMo(100 mg瓜g，i.p.)或BQ一123(1 mg瓜g，i.p.)预处理后，并不能改善LPS对C扩气ATPase活性的抑制作用。浙江大学?