【背景】放射性脑损伤是头颈部肿瘤放射治疗后经常发生的一种严重并发症。除医源性放射性脑损伤外,放射事故性损伤如意外核泄露、战争中的核武器损伤也可能造成放射性脑损伤。脑、脊髓接受过量照射后可导致局部出现水肿,梗塞或坏死,严重影响病人的生存质量。临床观察结果表明,认知功能损害的严重程度与内侧颞叶受照射剂量有关,可能与海马功能受损有关,因为海马区神经元对放射线非常敏感。放射性脑损伤已成为治疗头颈部肿瘤的剂量限制性因素,治疗效果差。预防或减轻放射性脑损伤是放疗学家和神经学家关注的课题,对提高患者的生存质量具有重要的临床价值和社会意义。迄今为止,多数学者认为放射性脑损伤是多因素共同作用的结果。放射线通过直接物理损伤和产生自由基导致的间接损伤作用,损伤神经细胞,引起脑组织退行性病变。中枢神经系统中,海马区和室管膜下区是对辐射最敏感的区域,此区域内的神经细胞破坏将影响放射性脑损伤的程度及恢复。另一种学说是血管损伤学说,此学说认为血管内皮细胞死亡增加导致血管损伤、缺血,而血管损伤是晚期放射性脑损伤的主要病理基础之一。放射性脑损伤也可能是由于自身免疫反应所致:少突胶质细胞及其酶系统在照射后产生自身抗原,诱导自身免疫反应,导致脱髓鞘、脑水肿等改变,加重神经细胞的损伤。放射能引起细胞凋亡,是在若干基因指导下一系列生化级联反应的结果,主要的生化变化有:DNA损伤、细胞信号转导系统发生变化、激酶活化、细胞膜结构改变等。DNA是放射线作用于细胞最重要的靶,DNA单链或双链断裂,引起激酶的活性改变,激活一系列信号转导通路,破坏细胞膜及骨架结构,导致细胞退行性变和功能失调。最近很多研究集中于Cdk5(cyclin-dependentkinase 5细胞周期依赖性蛋白激酶5)在多种毒性物质诱导神经元凋亡中的调节作用,并发现Cdk5在神经退行性病变的发生、发展中发挥重要作用,这一发现引起了神经学界的广泛关注,但对于Cdk5在神经元放射性损伤中的作用,尚未有相关的文献报道。Cdk5属于丝氨酸/苏氨酸周期素依赖性蛋白激酶,是细胞周期素依赖蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase 5 Cdks)家族中特殊的一员,不参与细胞周期的调控。生理状态下,Cdk5在P35、P39等调节亚基的信号作用下锚定于膜上,磷酸化膜性底物,通过平衡促凋亡和促存活信号转导通路,在神经元发育、迁移、神经元存活中发挥重要作用。Cdk5表达于全身各个组织,然而非周期素蛋白P35、P39特异地存在于中枢神经系统(CNS)中,因此,Cdk5激酶激活主要限于中枢神经系统是因其激活剂分布局限性所致。也有研究发现周围神经系统的三叉神经节的感觉神经元的萎缩与Cdk5有关,认为Cdk5在周围神经系统的发育中也起着重要作用。缺乏Cdk5及其调节亚基的胎鼠大脑可损害神经元,包括海马区、大脑皮层、小脑、嗅球、丘脑及脑干。Cdk5基因敲除技术可使大脑皮层缺失,而导致胎鼠死亡。Cdk5在哺乳动物海马神经元的学习和记忆功能中也发挥着重要作用。如果Cdk5在病理状态下被过度激活并异常分布,可能导致神经元变性坏死。Cdk5在多种人类神经退行性疾病中起非常重要的作用,可能是构成包括阿尔茨默氏病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、进行性核上性麻痹(PSP)、Pick病等神经变性疾病的主要分子病理基础。DNA损伤是神经退行性病变的触发因子。一般情况下,外界毒性因素作用于神经元,引起DNA损伤,通过一系列信号转导,引起钙离子过度释放,引起钙离子激活的蛋白水解酶Calpain激活,水解P35为P25和P10,P25与Cdk5结合,通过一系列底物的磷酸化,破坏神经元的膜和骨架结构,导致神经元凋亡。有文献报道,在原代皮层神经元中,神经兴奋性毒素、缺氧负荷、钙内流都可导致P25蛋白表达的增加。如果证实Cdk5及其调节亚基P35/P25、P39在放射性脑损伤中发挥促凋亡作用,那么我们就可以通过对它们进行调节,而达到对脑放射性损伤的防护和治疗价值,提高治疗神经肿瘤的放疗效果。本实验通过建立放射性脑损伤大鼠模型,探讨Cdk5的调节亚基P35、P25在放射性脑损伤中所起的作用及其机制。【目的】1)建立大鼠放射性脑损伤模型并观察照射后海马区神经元的改变,确定放射性脑损伤与剂量的关系,为临床放射治疗剂量的确定提供理论依据;2)观察单次全脑照射后大鼠海马区神经元P35及P25蛋白表达的变化,探讨放射性脑损伤的机制,为寻找放射性脑损伤的防治方法提供新的思路。【方法】1)将72只雄性SD大鼠随机分为单次全脑照射0Gy、10Gy、20Gy、30Gy 4个组,构建大鼠的放射性损伤模型;2)应用尼氏染色观察照射后不同时间点(照射后3h、6h、12h)各组大鼠海马CA1区神经元的数目,观察各剂量组与时间点神经元数量的变化;3)成功建立大鼠放射性损伤模型后,将12只SD雄性大鼠随机分为0Gy、10Gy、20Gy、30Gy4个组,每组3只大鼠。蛋白质印迹实验检测各剂量组海马区P35、P25蛋白的表达变化;4)另取9只SD大鼠,蛋白质印迹实验检测大鼠经全脑30Gy剂量照射后各个时间点(照射后3h、6h、12h,每组3只大鼠)P35、P25蛋白的表达变化。【结果】1)照射后可观察到海马区神经元死亡,成功建立大鼠放射性脑损伤模型;2)与对照组相比,10Gy组海马CA1区神经元数目无显著变化(P＞0.05)。20、30Gy组神经元数目有显著变化(P＜0.05);与照射后3h、12h比较,照射后6h神经元数目有显著性变化(P＜0.05);3) Western blot实验结果显示:与对照组相比,10Gy组P35蛋白表达无显著变化(P＞0.05);20Gy、30Gy照射组P35表达减少(P＜0.05)。10Gy组P25蛋白表达无显著变化(P＞0.05);20Gy、30Gy照射组P25蛋白表达增强(P＜0.05);4)大鼠全脑照射后各时间点P35及P25蛋白表达的变化:大鼠全脑照射30Gy后3h、12h大鼠海马神经细胞中P35、P25蛋白表达无显著差别(P＞0.05)。照射后6h,P35蛋白表达减弱(P＜0.05),P25蛋白表达增强(P＜0.05)。【结论】1)放射性损伤可导致海马区神经元损伤,损伤程度与剂量大小有关;2)海马神经元的死亡可能与P35、P25蛋白表达变化有关。