目的：　　 1.在浙江省不同地市聋哑学校或特殊教育学校、医院耳鼻喉科门诊收集非综合征型耳聋(nonsyndromic sensorineural hearing loss，NSHL)病例，分析全省非综合征型耳聋患者的线粒体tRNAAsp基因突变情况，完善线粒体tRNA与耳聋的相关性研究。　　 2.筛查收集样本的线粒体tRNAAsp基因突变位点，分析筛查结果。　　 3.对一个携带有线粒体tRNAAsp A7551G突变家系进行临床资料和遗传特征分析，从而研究A7551G与耳聋的相关性。　　 4.构建携带线粒体tRNAAsp A7551G突变的耳聋家系的永生化淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell lines，LCLs)，为后续功能实验奠定基础。　　 5.进行部分LCLs细胞功能实验，初步探讨线粒体tRNAAsp A7551G突变与耳聋的相关性。　　 方法：　　 1.分别收集各地NSHL患者血液标本2953例，正常对照血液标本712例。进行临床资料收集，全血基因组DNA提取，建立临床和分子遗传学资料数据库。　　 2.聚合酶链反应(polymerise chain reaction，PCR)技术扩增线粒体tRNAAsp基因，产物纯化后测序，利用生物信息学方法筛查线粒体tRNAAsp基因突变情况，并分析突变位点的保守性指数、突变频率和基因多态性等。　　 3.对携带有线粒体tRNAAsp A7551G突变家系进行家系回访，完善家系成员的临床资料。　　 4.对先证者进行线粒体基因组全序列分析，评估7551位点突变对线粒体tRNAAsp基因二级结构的影响，利用生物信息软件查询7551位点的保守性，分析该家系母系成员的线粒体单体型。评价线粒体tRNAAsp A7551G突变与耳聋的相关性。　　 5.利用EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)转染外周血B淋巴细胞(B lymphocytecell，BLC)，构建线粒体tRNAAsp A7551G突变家系的LCLs。　　 6.对LCLs细胞进行细胞倍增时间(doubling time，DT)测定、细胞内活性氧(reactiveoxygen species，ROS)水平检测、线粒体膜电位(mitochondridal membrane potential，MMP)检测，初步分析LCLs细胞功能变化。　　 7.统计学分析，统计家系成员LCLs细胞和正常对照LCLs细胞在细胞功能方面，结果是否有统计学差异。　　 结果：　　 1.对收集的NSHL和正常对照样本进行线粒体tRNAAsp基因突变筛查后发现存在9个基因突变，其中4个已报道，其余5个均未被报道过，分别是T7546C、A7551G、C7567T、A7570G和T7572C。通过分析发现只在NSHL患者中存在tRNAAsp A7551G突变，该位点位置特殊，保守性较高，很可能与耳聋的发生密切相关。　　 2.线粒体tRNAAsp A7551G突变耳聋家系为母系遗传，家系内母系成员均携带有tRNAAsp A7551G突变，而父系成员及配偶均不存在此突变位点。　　 3.先证者全序分析发现共存在28个基因突变，在tRNA基因上只存在1个突变:tRNAAsp A7551G突变。结合线粒体tRNAAsp二级结构发现7551位点位于tRNAAsp基因二级结构的A37位点，即线粒体tRNAAsp基因的反密码子环旁。家系先证者及其母系成员线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)单体型为A4。　　 4.构建了该耳聋家系成员及家系外正常对照样本的LCLs，复苏后细胞增殖状态良好，染色体核型分析发现LCLs细胞的染色体为正常二倍体核型，且测序发现该家系LCLs细胞仍存在tRNAAsp A7551G突变位点。　　 5.进行LCLs细胞功能实验后，发现该耳聋家系LCLs细胞倍增时间比正常对照LCLs细胞倍增时间延长，该耳聋家系LCLs细胞ROS水平比正常对照LCLs细胞ROS水平增加33.01％。该耳聋家系LCLs细胞MMP比正常对照LCLs细胞MMP降低27.07％。　　 结论：　　 1.线粒体tRNAAsp基因突变筛查发现，在NSHL患者和正常对照人群中共存在9个突变位点，基因突变数目和分布在NSHL患者和正常对照人群中有所差异，推测线粒体tRNA基因突变很可能参与了疾病的发生。　　 2.对比NSHL患者和正常对照人群中线粒体tRNAAsp基因突变情况，发现在NSHL患者中存在A7551G突变位点，而正常对照人群中不存在此位点，分析发现该位点在16种灵长类物种中均高度保守，该位点存在于线粒体tRNAAsp基因二级结构的A37位，该位置易发生硫醇化和甲基化修饰作用，对于密码子的高保真识别、tRNA的构型和功能稳定都起着重要作用。该位点的突变很可能影响了线粒体tRNA结构稳定性，从而导致线粒体功能障碍，引发耳聋。　　 3.家系成员发病年龄、严重程度有一定差异，这提示耳聋的发生还可能与个体的自身素质和所处环境或其他一些修饰因子有一定关系。　　 4.成功构建的家系LCLs细胞功能实验初步证实，当个体携带线粒体tRNAAsp基因A7551G突变时，个体细胞内线粒体功能会发生障碍，导致相应的细胞功能异常。分析这可能是由于存在线粒体tRNAAsp基因A7551G突变时，导致多种酶含量降低或缺失，影响细胞呼吸链的中间体活性，从而导致线粒体活性降低、细胞和组织病变，最终导致耳聋。为了证实线粒体tRNAAsp A7551G突变的作用机制，还需进一步实验验证。