论文部分内容阅读
番鸭(Cairna moschata),又称疣鼻栖鸭,属于栖鸭类。华盛顿公约(CITES)将其野生种群列入附录三物种。野生番鸭栖息于热带地区,目前,在墨西哥、巴西和巴拉圭等国有其野生种群。因为番鸭具有较大的经济价值,其人工饲养数量逐年不断增加。番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus, MDPV)引起,以1-3周龄雏番鸭为易感的一种急性传染性、高死亡率的病毒病。耐过鸭往往生长发育迟缓,成为僵鸭,失去其经济价值。该病呈世界范围分布,给番鸭养殖业带来巨大的经济损失。MDPV只有一个血清型,从世界各地分离的病毒仪有微小差异。番鸭感染MDPV后,主要以体液免疫反应为主。B细胞抗原表位决定着机体产生抗体的特异性,是诱导体液免疫的基本单位。但至今国内外对MDPV蛋白的B细胞抗原表位知之甚少。病毒的非结构蛋白是在病毒复制过程中产生的,感染动物会产生抗非结构蛋白的抗体,而灭活疫苗或亚单位疫苗免疫的动物不会产生针对病毒非结构蛋白的抗体。因此可以利用非结构蛋白抗体的存在与否来区分灭活疫苗免疫动物和自然感染动物。为了对MDPV YL08株NS1蛋白(氨基酸序列全长627 aa)进行抗原表位作图,本研究设计了一套覆盖整个NSl蛋白的短肽,这些短肽长为30个氨基酸左右,有10个氨基酸重叠。为了表达这些短肽,共设计合成了31对互补的寡核苷酸片段。每对寡核苷酸片段5’端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后,插入至原核表达载体pET-32a中,经IPTG诱导获得了相应重组蛋白的表达。利用切胶纯化的方法对表达蛋白进行了纯化。纯化蛋白经抗His单克隆抗体鉴定。应用MDPV YL08株人工感染番鸭血清对表达的31个重组蛋白的抗原性进行了检测,Western blot结果表明,表达的融合蛋白NS (481-510)、NS (501-530)、NS (521-550)、NS (541-570)、NS (561-590)、NS (581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所识别,而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所识别。综合上述试验结果,MDPV YL08株NS1蛋白的B细胞线性抗原表位区位于NS1蛋白的羧基末端481-627 aa。Dot-ELISA试验结果表明融合蛋白NS(501-530)的抗原性最强。以纯化的融合蛋白NS(501-530)为包被抗原建立了间接ELISA检测方法。确定了灭活疫苗免疫番鸭和自然感染番鸭的临界值为0.300。对240份阳性血清进行检测,阳性符合率为100%。对100份阴性血清进行检测,检测结果为：30份健康番鸭血清中有1份的检测值略高于临界值；70份灭活疫苗免疫血清中有1份的检测值略高于临界值,检测准确率为98.0%。本研究建立的ELISA检测方法与鸭瘟病毒(Duck plague virus, DPV),鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)和鸭呼肠孤病毒(duck reovirus, DRV)等阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果表明,该ELISA检测方法的敏感性优于中和实验。ELISA的板内及板间变异系数均小于10%,重复性较好。对含有抗原表位NS(501-530)的重组蛋白抗体消长规律分析表明,重组蛋白抗体在番鸭感染MDPV后第1周即可检测到,第3周达到最高峰,以后效价开始略有下降,一直可持续到第12周。上述实验结果可证明该ELISA检测方法可应用于MDPV灭活疫苗免疫番鸭和MDPV自然感染番鸭的鉴别诊断。本研究建立的基于NS蛋白抗原表位的ELISA检测方法,为MDPV的快速诊断、疫情监测、流行病学调查和免疫抗体效价测定提供了一定的技术支持。特别为将来使用灭活疫苗(或重组结构蛋白亚单位疫苗)免疫番鸭时鉴别自然感染番鸭与疫苗免疫番鸭奠定了一定的技术储备。