巨大芽孢杆菌B196菌株产抗菌物质的发酵条件优化及分离鉴定研究

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本研究优化了巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) B196菌株产生拮抗物质的发酵条件,对该菌产生的拮抗物质进行分离纯化和鉴定,并对其特性和抑菌活性进行研究。所获得的结果如下:1、通过单因素试验筛选出培养B196菌株高产抗菌物质的最佳碳源、氮源和无机盐分别为蔗糖、蛋白胨和氯化钠,通过正交试验获得B196菌株发酵的培养基配方为蔗糖10g/L,蛋白胨20g/L, NaC17g/L, K2HPO45g/L;最佳条件为:温度27℃,时间5d,接种量1%,pH7.0,装液量40mL/200mL。2、从B196菌株的代谢产物中分离纯化获得的化合物,双缩脲反应表现为阳性,茚三酮反应开始表现为阴性,但经过水解后表现为阳性;该化合物含有Asx、Glx、Pro、 Ser和Tyr等5个氨基酸,它们的摩尔比约为3:1:1:1:1:该化合物的分子量为1042.5927Da;利用碰撞诱导解离(CID)技术所获知其离子碎片与Iturin A家族中Iturin A2吻合,故将该化合物鉴定为Iturin A2。3、以水稻纹枯病菌为指示菌,测定从B196菌株的代谢产物中分离纯化获得的化合物的稳定性。结果表明,该化合物在90℃处理60min和121℃高温高压处理20min后抑菌活性分别下降了40.45%和60.45%;该化合物经不同的pH处理24h,在pH2-10时抑菌活性没有发生变化,但在pH为12时活性下降;该化合物对胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶不敏感。采用菌丝生长速率法,测定了化合物对7种植物病原真菌的活性,结果表明,其对7种供试植物病原真菌均有活性,其中对水稻稻瘟病菌(Pyricularia grisea)的活性最强;采用抑菌圈法测定化合物对植物病原细菌的活性,发现其对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)、水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. Oryzae)和番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)等5种植物病原细菌有抑菌活性,但是对大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. Glycinea)、番茄细菌性斑点病菌(P. syringae pv.Tomato)和魔芋软腐病菌(Pectobacterium carotovora subsp. crotovora)无抑菌活性。4、B196菌株产生的纯拮抗物质浓度为40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL时,对水稻纹枯病的防效分别为84.01%、97.47%、100%。
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