野鸟一直被认为是禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的自然宿主。野鸟在众多亚型AIV的保存、传播和变异中发挥极其重要的作用。从家禽以及包括人等哺乳动物体内分离到的流感病毒均直接或间接来源于野鸟。为了解我国野鸟种群中AIV的流行情况及其生物学特性,本研究在2017-2019年期间,从全国主要野鸟栖息地采集新鲜粪便样品6356份,共分离到25株AIV,AIV分离率约为0.39%。亚型鉴定显示HA亚型5种,NA亚型4种,形成了7种不同组合,包括3株H3N8、3株H6N1、3株H6N2、1株H6N8、12株H9N2、1株H13N8和2株H16N3。其中,本研究分离的2株H16N3是该亚型AIV在我国西部首次分离。HA基因裂解位点分析发现,本研究所有分离株均为低致病性禽流感病毒,但1株H3N8亚型AIV出现了对哺乳动物致病性增加的分子标志(PB2蛋白E627K突变)。遗传进化分析结果显示:H3N8、H6、H9N2(12株中的2株)、H13N8和H16N3多亚型共15株病毒的HA基因属于欧亚分支,10株H9N2病毒划分为北美分支;除1株H6N8和1株H9N2病毒的NA基因来自北美分支,其他23株病毒的NA基因均来自欧亚分支。25株病毒内部基因PB2和PA可以划分为8个亚分支,PB1、NP和M基因均可划分为7个亚分支,NS基因可划分为5个亚分支。基因型划分显示,25株病毒可以划分为18个基因型,呈现多亚型重组的特点。家禽感染性实验表明,野鸟源H9N2亚型AIV不能跨种感染SPF鸡,但是有2株病毒可以引起感染鸡出现血清转阳,这说明当前在我国野鸟携带的H9N2亚型AIV对家禽危害有限。哺乳动物感染性实验表明,WB/TJ/2-300/2018(H3N8)可以突破血脑屏障在小鼠脑内以低滴度复制,其他9株病毒(3株H6、4株H9N2和2株H16N3)均不能在脑中复制。3株H6亚型和3株H9N2亚型AIV均能在小鼠的鼻甲和肺脏复制,但其复制能力不同。表明野鸟源AIV大多可以在不经提前适应的条件下感染小鼠,存在跨种感染哺乳动物甚至人类的可能。两株H16N3病毒不能在小鼠体内有效复制,表明其对哺乳动物不致病。通过反向遗传学技术,我们发现PB2基因E627K的自然突变可以显著增加H3N8亚型AIV在肺脏的复制滴度,并增强了小鼠的致病力。这表明野鸟源H3N8亚型禽流感病毒在自然条件下获得E627K突变从而增强其对哺乳动物的致病性。综上所述,我国野鸟源携带的AIV具有丰富的遗传多样性,虽然不能跨种感染家禽,但是部分病毒可以不经提前适应直接感染小鼠,存在感染人类的潜在风险。因此,持续加强野鸟的AIV监测将使我们能够更好了解AIV的流行状况和生物学特性,为禽流感疫情提供早期预警,并为禽流感的科学防控提供重要的数据支撑。