论文部分内容阅读
棉花纤维细胞是自然界中最长的单细胞之一。提高棉花纤维品质能为纺织工业提供优良的原材料。现在各种生物和非生物逆境因子（高温、干旱、盐碱、病虫害、矿质营养缺乏及重金属毒害等）对棉花的产量和品质造成的影响日趋严重。因此,研究逆境条件下纤维发育的生物学问题能为纤维品质的改良提供新的方法和思路。本研究以胚珠培养体系为工具,结合转基因技术研究了矿质元素缺乏及氧化胁迫等逆境因子对纤维品质的影响。并通过一系列的研究阐述了Ca或者K缺乏诱导的信号与激素（ABA、JA）和ROS相互作用调控纤维伸长的分子机制。通过改变GhAPX1基因表达量来调节纤维细胞内源H2O2和ASA含量的方法,探讨细胞内H2O2含量与纤维细胞伸长之间的关系,详细论述了ASA与ABA调控缺铁条件下纤维发育的作用机制。具体结果如下:1.胚珠培养发现低钙和低钾共同作用促进纤维伸长通过胚珠培养系统研究了11种矿质元素含量变化（K、Ca、Mg、P、Fe、Mn、Zn、B、Cu、Mo和Co）对棉花胚珠和纤维发育的影响,发现培养基中矿质元素含量对纤维发育的作用存在一个最适宜的浓度。缺钙能够促进纤维早期的伸长并诱导纤维的褐化（培养2天后）,低钾（2 mM或者27 mM）能显著抑制纤维的伸长。但当培养基中低钾和缺钙同时发生时,纤维长度比对照（低钾和钙正常）更长并且纤维褐化显著向后推迟（8天以后）。通过RNA-seq和离子组含量的分析,发现缺钙诱导了XTH/PME等基因的上调表达促进细胞壁松弛,同时激活CIPK6基因的表达促进了K离子吸收,促进了纤维伸长。但是钙缺乏诱导了胚珠和纤维中大量ROS的累积、JA含量的下降以及ABA的完全缺失,致使胚珠和纤褐化。低钾（2 mM或者27 mM）能够通过上调抗氧化基因的表达以及提高JA和ABA的含量来抑制褐化。低钙诱导的细胞伸长与低钾诱导的信号互补,共同作用促进了纤维的伸长。2.H2O2是纤维伸长的重要调控因子矿质元素的缺乏诱导ROS的累积,诱导组织的褐化并抑制纤维的伸长。H2O2的含量在纤维发育转换期（15 DPA）有一个小高峰。在胚珠培养中施加不同浓度的H2O2和ROS生成的抑制剂DPI能够改变纤维的发育进程,这些结果说明H2O2能够调控纤维伸长的过程。为进一步研究纤维中内源H2O2的含量与纤维长度之间的关系,对棉花纤维伸长期（5-10 DPA）优势表达的基因GhAPX1AT/DT的表达量进行了调控。构建了该基因CaMV35S超量表达和特异干涉以及细胞质APX家族干涉的三种载体,并成功转化陆地棉。通过对转基因棉花材料纤维品质多年多点的检测,发现35S超量表达棉花（OA）和GhAPX1AT/DT特异干涉（IAU）棉花纤维品质变化不大,只有细胞质类型APX干涉（IAO）类型的两个棉花株系纤维长度（26.06±0.31 mm和25.71±0.63 mm）相比阴性对照（28.42±0.67 mm）显著降低,下降幅度达8.30%-9.54%。并且纤维整齐度指数,伸长率,成熟度和短纤维指数也都相对于对照下降,纤维品质变差。主要原因是H2O2在细胞质APX干涉系中大量累积,抑制了纤维的伸长,特别是10 DPA纤维中H2O2含量增加了3.5倍。通过RNA-seq技术,在细胞质APX干涉系10 DPA纤维中筛选到126个差异表达基因（DEGs）。其中在IAO株系上调表达的基因大部分在纤维次生壁时期优势表达,并且参与到氧化还原稳态,胁迫响应和次生壁合成等过程。因此,细胞质APX基因是纤维细胞伸长期氧化还原稳态维持的关键基因,抑制细胞质APX基因表达会导致H2O2含量的大量累积,诱发氧化胁迫,刺激次生壁基因在伸长期的提前表达,从而抑制了纤维的伸长。3.降低细胞质APX的表达量能提高棉花缺铁的耐受性超量表达GhAPX1能够增加纤维对高温（37oC）和氧化胁迫（1 mM H2O2）的耐受性,细胞质APX干涉株系纤维对高温和氧化胁迫更加敏感。但是,细胞质APX干涉株系表现出对缺铁更不敏感的表型。胚珠培养中缺铁能够抑制胚珠和纤维的发育,并在培养10天后诱导组织的褐化。缺铁诱导的褐化在细胞质APX干涉系胚珠和纤维出现的时间明显向后推迟,并且胚珠没有受到缺铁的抑制,FCR活性相比于正常条件显著上升,同时细胞质APX干涉系幼苗叶片在缺铁处理两周后没有出现严重的黄化,这些结果表明细胞质APX表达的下调提高了棉花缺铁耐受性。进一步分析表明细胞质APX干涉系缺铁的耐受性的提高依赖于ASA含量的显著上升。首先,RNA-seq分析发现ASA合成和代谢途径的基因都受到了缺铁的调节,ASA含量上升。其次,ASA增加的幅度在缺铁处理的细胞质APX干涉系中显著高于对照和超表达系。再次,外源施加ASA能够抑制缺铁诱导的褐化,恢复胚珠的鲜重及高铁还原活性,而外源施加H2O2却不能达到上述效果。4.ABA能提高棉花对缺铁的耐受性ASA一方面通过激活铁吸收相关基因的上调表达增加耐受性,另一方面通过维持ABA的含量来降低缺铁对胚珠和纤维造成的损害。在缺铁处理6-10天后,胚珠和纤维中ABA的含量显著下降,ABA含量下降的速度和比例在细胞质APX干涉系中远远低于对照和超表达株系。对ABA合成和降解相关基因的检测发现细胞质APX株系缺铁条件处理10天后,ABA合成相关基因的表达没有受到抑制;并且ABA降解相关基因的表达受缺铁诱导上调的幅度显著低于对照和超表达株系。外源施加10μM浓度的ABA能够抑制缺铁诱导的纤维的褐化并能够恢复缺铁抑制的高铁还原活性,说明ABA能胚珠和纤维缺铁的症状。进一步的分析发现,超表达ABA降解相关基因GhABAH1（脱落酸8’羟化酶）后棉花ABA的含量显著下降,胚珠和纤维对缺铁更加敏感,褐化表型早于对照出现。以上结果表明细胞质APX基因表达的下调可以维持胚珠和纤维缺铁条件下ABA的含量,从而提高棉花对缺铁的耐受性。