脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的修复是尚未解决的世界性难题。研究表明,减轻继发性损伤是促进SCI修复和改善患者临床预后的关键环节。巨噬细胞(M?)是参与SCI继发性损伤最重要的炎症细胞。应答于损伤区内环境中不同的细胞因子,巨噬细胞表现出M1和M2两种细胞表型。其中,对SCI修复起负面作用的M1型巨噬细胞不仅数量众多,且分布广泛,在病程中占据主导地位;而起正面作用的M2型巨噬细胞仅一过性增高,且分布相对集中。巨噬细胞这种不平衡的极化特性,是SCI修复不可逆的重要因素之一。调节SCI后M1/M2型巨噬细胞的比例,特别是抑制M1的表达数量,减轻炎症反应可显著促进损伤脊髓的功能恢复。药物干预、细胞移植等现有研究手段,虽能在一定程度调整巨噬细胞极化,但存在药物安全窗窄、免疫排斥反应、临床难以有效实施开展等多种不足,亟需寻找一种更安全、有效、简便可行的治疗方法。弱激光治疗(Low-level LaserTherapy,LLLT),作为一种经典的物理治疗手段,具有安全、无创、实施简便等优点以及显著的抑炎、促修复作用,目前已广泛应用于皮肤病损、外周神经损伤等临床多个领域。课题组前期研究发现,LLLT可以减轻SCI大鼠损伤部位的炎症反应,抑制胶质瘢痕的形成,促进运动功能的恢复;初步的临床试验结果也证实了LLLT具有促损伤修复的效应。深入研究发现,LLLT可以调节SCI后大鼠损伤区巨噬细胞的极化状态,下调M1的数量,抑制促炎因子TNF-α、IL-13、IL-1β的分泌;上调M2的比例,促进抑炎因子IL-4和神经营养因子BDNF的分泌,增加神经元存活与轴突再生,促进脊髓损伤修复。但是,LLLT是否可以在体外直接作用于M1型骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophage,BMDM),发挥调控M1表型极化和分泌的作用?这种调控作用是以何种途径实现的?在促脊髓损伤修复中的作用是什么?这几点尚不明确。已往研究表明,NF-κB信号通路在调控M1型巨噬细胞极化过程中扮演着重要角色。激活NF-κB可促进巨噬细胞向M1方向极化。那么,NF-κB信号通路是否参与LLLT调控M1表型极化?LLLT条件下NF-κB是如何调控巨噬细胞极化的?带着上述问题,我们开展了以下三方面的研究。实验一:810nm弱激光对M1-BMDM表型极化的影响目的:研究弱激光照射对原代M1型巨噬细胞活性及极化水平的作用方法:Balb/c小鼠骨髓中分离培养原代巨噬细胞,LPS+IFN-γ刺激诱导巨噬细胞M1表型极化,采用流式细胞术检测培养和极化情况。将成熟的M1型巨噬细胞随机分为弱激光照射组与对照组。照射组采用输出功率2mW/cm~2、光斑面积4.5cm~2,通过照射时长44s、440s、1111s,分别获得0.4J、4J和10J能量参数照射组;对照组置于暗箱,不给于照射。照射后2和24小时,使用CCK-8法对各组细胞进行活性检测,RT-qPCR检测各组细胞iNOS的mRNA表达水平。照射后24小时,Western-blot检测各组细胞iNOS蛋白的表达水平,免疫荧光染色检测各组细胞iNOS蛋白的表达及定位。结果:各能量参数弱激光照射后2小时,对应各组细胞的活性均未发生明显改变;4J组弱激光照射后24小时,细胞活性显著提高。各量参数弱激光照射后2小时,对应各组细胞iNOS的mRNA水平均未发生明显改变;照射后24小时,对应各组细胞iNOS的mRNA水平较对照组均显著下调,以4J组下调效果最为明显。照射后24小时,较对照组,0.4J和4J组显著下调iNOS蛋白水平,4J组效果较0.4J组更为明显。iNOS~+细胞比例在0.4J和4J组也显著降低,4J组较0.4J组下降趋势更为显著。结论:810nm弱激光抑制M1-BMDM表型极化的作用在剂量和反应时长上具有一定的依赖性,且所选参数是安全可靠的。实验二:810nm弱激光调控M1-BMDM分泌对神经元轴突的影响目的:研究弱激光影响M1-BMDM分泌对被根神经节细胞轴突的作用方法:弱激光照射条件和细胞分组同实验一。各组弱激光照射后24小时,RT-qPCR检测M1-BMDM促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA水平,ELISA法检测M1-BMDM上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、BDNF及NGF的浓度,免疫荧光染色法检测经弱激光照射后M1-BMDM上清过继培养背根神经节细胞24小时后,其轴突生长长度,Western-blot检测转录因子NF-κBp65及其磷酸化蛋白表达水平。照射后2小时和24小时,探针检测M1-BMDM中ROS的含量。结果:照射后24小时,较对照组,各照射组TNF-α和IL-1β的m-RNA表达显著下调,IL-1β的分泌也被显著抑制;4J和10J照射组TNF-α的分泌水平及典极化转录因子NF-κB p65及其磷酸化蛋白表达显著下调;4J照射组IL-6的m-RNA表达和分泌被显著抑制,神经营养因子BDNF和NGF分泌水平显著上调。照射后2小时,较对照组,10J组M1-BMDM中ROS含量显著上升,24小时后,较对照组,4J组ROS含量显著降低。上清移液培养背根神经节细胞24小时后,较对照组,4J及10J组的上清液显著促进背根神经节细胞轴突的生长。结论:弱激光照射可以显著抑制M1-BMDM分泌促炎因子,减弱氧化应激水平,且这种作用可能是通过抑制NF-κB p65及其磷酸化蛋白表达的途径实现的,此外,弱激光具有促进M1-BMDM神经营养因子分泌帮助神经元轴突生长的作用。实验三:810nm弱激光通过Nrf2/NF-κB信号通路调控M1-BMDM表型极化目的:研究弱激光调控M1-BMDM表型极化的机制方法:将细胞分为对照组、M1组、M1+LLLT组、M1+LLLT+Nrf2-si-RNA组,选4J能量参数810nm弱激光对M1+LLLT组和M1+LLLT+Nrf2-si-RNA组进行照射,其余两组置于暗箱,不给于照射。照射后24小时,运用Western-blot检测各组细胞iNOS、Nrf2、NF-κbp65、p-NF-κbp65、p-Ikk-β、IκB-α及p-IκB-α的蛋白表达水平。运用RT-qPCR检测各组细胞中iNOS、Nrf2、NF-κbp65、TNF-α、IL-1β及IL-6的m-RNA表达水平。运用ELISA检测各组细胞TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌水平。运用免疫荧光染色和Western-blot检测Nrf2和NF-κbp65的入核水平。结果:我们建立了一个体外M1型骨髓源性巨噬细胞(M1-BMDMs)弱激光疗法模型,结果表明,弱激光照射可以激活M1型骨髓源性巨噬细胞的抗氧化应激经典转录因子Nrf2,同时抑制经典IKK-β/IκBα/NF-κB p65信号通路。通过RNA干扰技术使Nrf2沉默,我们构建了M1-BMDM弱激光疗法的体外模型,进一步研究弱激光调节NF-κB p65的特异性机制。研究结果显示通过沉默Nrf2,可以逆转弱激光疗法对IKK-β/IκB-α/NF-κB p65信号通路的调节作用,而且M1-BMDM分泌的促炎因子也表现出了一致的变化。结论:弱激光调控Nrf2/ikk-β/ikb-α/NF-κBp65信号通路抑制M1型巨噬细胞的表型极化和促炎因子分泌。