鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，尤其在广东及其周边地区。近年来治愈率虽有所提高，但国内5年生存率仍在50％～55％之间。随着病毒分子生物学迅速发展，肿瘤的病毒治疗正逐步从实验室进入临床。但其进展缓慢，主要原因是传统的病毒治疗缺乏肿瘤细胞靶向性，无法进一步提高其肿瘤杀伤能力。直到上个世纪下叶，分子生物学取得突破性进展，人们对病毒的基因结构和功能有了更深的认识，能够通过基因工程技术对病毒进行人工改造，出现了肿瘤特异性增殖型病毒(Tumor-specificreplication-competentviruses)，这种状况才有所改变。这种病毒的特点是靶向性作用于肿瘤细胞，对正常细胞几乎没有影响。与传统治疗方法机制完全不同，病毒在肿瘤细胞内大量增殖，溶解肿瘤细胞后，释放出的子病毒能够进一步杀伤周围的肿瘤细胞，不断重复此过程，理论上直到肿瘤细胞全部被杀灭。这种治疗肿瘤的方法，一般不引起严重的毒副作用，无限毒剂量。代表此类病毒的是美国ONYX药物公司研制的增殖型腺病毒ONYX-015。虽然它的出现曾给肿瘤的治疗带了希望，然而其单独使用时的疗效很小，有效率仅为15％。须联合毒副作用很大的放化疗措施，才能较为有效地杀伤肿瘤，有效率为63％。 基因治疗成为当前肿瘤治疗的一个热点。由于目前所采用的病毒载体靶向性不佳，转染效率不高，基因导人体内后表达水平不理想以及安全性差，在很大程度上制约了肿瘤的基因治疗。 肿瘤靶向性基因-病毒疗法的出现，为肿瘤的治疗带了新的希望。将治疗基因插入到利用肿瘤特异性增殖型腺病毒基因组中，以其作为输送载体，治疗基因将会随着病毒在肿瘤细胞内大量增殖而高水平表达，发挥病毒溶瘤及基因治疗的双重抗肿瘤作用，从而进一步克服各自的不足。 在人类肿瘤中，有60％以上的肿瘤发生与p53基因的突变或其蛋白功能失活有关，且其突变频率很高。因此，将野生型p53基因导入肿瘤细胞，以纠正其异常功能，发挥抗肿瘤作用。 为实现靶向性杀伤肿瘤细胞，本课题采用了人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子及缺氧反应元件(HRE)启动子调控的腺病毒转移载体SG502-△CR2，将携带p53基因的表达盒克隆入其中，与骨架质粒pPE3共转染293细胞，经同源重组获得了双靶向增殖型腺病毒SG502-p53。 通过细胞实验，证实了此病毒对鼻咽癌细胞具有高度的选择性及很强的杀伤能力，为鼻咽癌的体内治疗提供了一种新的生物学手段及实验依据。目的：构建携带p53基因的腺病毒转移载体SG502-△CR2-ins-p53，与腺病毒骨架质粒pPE3在293细胞中通过同源重组，获得具有表达p53基因能力的双靶向增殖型腺病毒SG502-p53；探讨此病毒对鼻咽癌细胞的杀伤效应，为鼻咽癌的体内生物治疗提供一种新的手段及实验依据。 方法与结果： 1、携带p53基因的腺病毒转移载体SG502-△CR2-ins-p53的构建，病毒的包装及其大量制备 由NCBI核酸数据库，搜索出人全长p53基因序列，大小为1182bp，合成该基因。PCR体外扩增，电泳，以试剂盒回收约为1.2kb大小的DNA片段.经EcoRⅠ与XbaⅠ酶切，过柱纯化后，插入到pUC19/EcoRⅠ+XbaⅠ，得到pUC19-p53，经测序，p53基因序列正确。又以EcoRⅠ和XbaⅠ酶切pUC19-p53，EcoRⅠ和NheⅠ酶切pClon16，两者酶切产物相连接，得到pClon16-p53。AgeⅠ和SpeⅠ切开pClon16-p53，与AgeⅠ和XbaⅠ酶切pClon9-ins得到的ins片段相连，获得pClon16-ins-p53。再以AgeⅠ和NotⅠ及ScaⅠ切该载体，回收大小为2449bpDNA片段。此片段即为携带p53基因的表达框，由ins，mCMVpromoter，p53gene和SV40poly-A组成。然后将此表达框插入经AgeⅠ和NotⅠ酶切后的SG502-△CR2载体中，得到转移载体SG502-△CR2-ins-p53。 将转移载体SG502-△CR2-ins-p53与腺病毒骨架载体pPE3共转染至293细胞内，携带p53基因的表达框经同源重组后，插入到腺病毒基因组的E1区。转染后第10天出现病毒空斑，显微镜下吸取空斑，经过三次病毒空斑纯化后，小量扩增，吸取上清，抽提病毒DNA。以p53基因上下游引物，进行PCR鉴定，重组正确的病毒再次感染293细胞，Elisa试剂盒检测其表达后，病毒被命名为SG502-p53。 腺病毒SG502-p53在293细胞中大量扩增后，收集病变的293细胞。以氯化铯梯度离心法纯化病毒，TCID50法测定其滴度为3.15×1010pfu/ml。 2、双靶向增殖腺病毒SG502-p53表达p53的检测 重组腺病毒SG502-p53分别感染CNE-1，CNE-2，CNE-3及HKM-1后，WesternBlot检测腺病毒SG502-p53在鼻咽癌细胞株中p53蛋白的表达；Elisa检测感染此病毒的CNE-1细胞中表达的p53蛋白。结果显示SG502-p53在鼻咽癌细胞株中均能大量表达wt-p53蛋白。 3、双靶向增殖型腺病毒SG502-p53杀伤鼻咽癌细胞株体外实验 3.1病毒增殖实验 重组腺病毒SG502-p53以MOI值为5感染人正常肝细胞株与上述四种鼻咽癌细胞株后，TCID50法测定0h、48h和96h三个时段病毒滴度，以了解病毒在上述细胞株中的增殖情况。实验数据表明SG502-p53在鼻咽癌细胞株中能随时间段的增加而大量复制增殖，但在正常肝细胞中的增殖力远远弱于鼻咽癌细胞中的。因此，SG502-p53对鼻咽癌细胞具有高度的靶向增殖能力。 3.2细胞活力实验(MTT)： 重组腺病毒SG502-p53以不同的MOI值感染上述四种鼻咽癌细胞株，7天后加入MTT，测定其吸收值，绘制MTT曲线图。数据显示SG502-p53能在很小的MOI值下杀伤鼻咽癌细胞。以CNE-2及CNE-3对此病毒最为敏感，其半杀伤剂量(IC50)分别为0.22±0.02及0.31±0.03。 3.3细胞病理效应(CPE)实验： 腺病毒SG502-p53以不同的MOI值感染上述四种鼻咽癌细胞株，7天后固定，染色。结果直观地显示此病毒对鼻咽癌细胞株均有很强的杀伤能力。其中以CNE-2最为明显，在MOI值仅为0.5时即可杀灭全部的CNE-2细胞。 实验结论： 本实验成功地构建了携带p53基因的增殖型腺病毒穿梭质粒SG502-△CR2-ins-p53；通过同源重组成功地获得具有高效表达p53基因能力的双靶向增殖型腺病毒载体SG502-p53；体外实验表明重组腺病毒SG502-p53能够选择性地在鼻咽癌细胞中高效增殖、杀伤鼻咽癌细胞。 因此，SG502-p53是一种集特异、高效、安全于一体的溶瘤性病毒，为进一步鼻咽癌的体内生物治疗提供了一种新的手段及实验依据。