第一部分NK细胞继发性胞吞颗粒酶B及其生物学意义NK细胞是一类重要的固有免疫细胞,在机体抗肿瘤、抗病毒中发挥重要作用。NK细胞最重要的生物学效应是杀伤靶细胞,其主要机制之一是:NK细胞与靶细胞接触而形成免疫突触,NK细胞脱颗粒并向突触释放效应分子,其中穿孔素可在靶细胞表面形成微孔道,颗粒酶循该孔道进入靶细胞内而介导凋亡。靶细胞内,颗粒酶启动凋亡相关的caspase级联反应,通过直接作用于pro-caspase,切掉天冬氨酸残基激活下游caspase而发挥作用。免疫突触内部分胞毒效应分子未进入靶细胞,其转归及功能尚不清楚,待阐明的问题是:滞留免疫突触内的穿孔素和颗粒酶是否会伤害NK细胞本身;其代谢与去向如何;等等。文献已报道,细胞毒性细胞可通过独特机制处理胞内错位的颗粒酶B（GzmB）和穿孔素（PFN）。例如,NK细胞内表达GzmB特异性抑制剂——丝氨酸蛋白酶抑制剂9（PI-9）,后者可及时灭活胞内渗漏的GzmB。鉴于NK细胞具有连续杀伤靶细胞的功能,我们提出如下推测:释放并滞留于免疫突触的效应分子可能被回收而重新利用。本课题以非何杰金淋巴瘤来源的NK92细胞系为模型,在靶细胞刺激下,探讨NK92细胞所释放GzmB的转归。一、NK92细胞在靶细胞刺激下出现继发性胞吞现象1.应用苯乙烯染料FM1-43观察NK92细胞继发性胞吞现象苯乙烯染料FM1-43可与细胞膜磷脂双分子层可逆性结合,发出荧光,而其在溶液中则几乎不能检出荧光。细胞发生内吞后,苯乙烯染料内吞入细胞内,细胞膜上荧光可用磷酸盐缓冲液洗掉。借此原理,本实验首先将NK92细胞用FM1-43预染,然后用猪内皮细胞（PEC）刺激1h,激光共聚焦显微镜（LCM）观察NK92细胞内吞情况。结果显示,未用PEC刺激的NK92细胞膜上显示荧光,PEC刺激的NK92细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞膜后,细胞内显示荧光,提示NK92细胞在胞吐后细胞膜发生内化。2.靶细胞刺激的细胞膜内吞过程依赖于clathrin细胞膜的内吞常见形式为依赖于clathrin的经典途径,也可依赖于巨胞饮（macropinocytosis）、小窝蛋白（caveola）和脂筏（lipid raft）等途径。我们采用clathrin特异性抑制剂CPZ预处理NK92细胞,再用FM1-43标记细胞膜,使用靶细胞刺激后激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光。实验结果显示,CPZ处理后NK92细胞内荧光强度显著降低,提示NK92细胞膜内吞依赖于clathrin途径。同时用流式细胞术检测细胞内荧光强度,结果显示使用CPZ后细胞内荧光强度约为对照组的48%。我们将NK92细胞用FM1-43标记,分为两组,分别用PEC在4℃和37℃刺激1h,结果显示:4℃条件下细胞并不发生内吞,提示NK92细胞内吞作用与温度相关,是一种主动内吞。二、靶细胞刺激NK92细胞继发性胞吞伴随GzmB回收1. NK92细胞内吞的GzmB进入早期内体NK92细胞膜内吞过程为经典的clathrin依赖途径,CPZ预处理的NK92细胞经靶细胞（PEC）刺激,收集未刺激组、刺激15min、30min的细胞,免疫荧光检测GzmB和早期内体EEA-1在胞内共定位情况,结果显示:未刺激组EEA-1与GzmB均有表达,二者未出现共定位;靶细胞刺激15min后,GzmB含量明显增多,GzmB与EEA-1有明显共定位,用CPZ处理后共定位显著减少。靶细胞刺激30min后,GzmB与EEA-1共定位比15min组减少。提示NK92细胞继发性胞吞伴随GzmB回收。为进一步验证上述结果,本实验设计针对clathrin蛋白重链的siRNA,采用核转染方法瞬时转染NK92细胞。转染后的细胞用靶细胞刺激15min,免疫荧光法检测GzmB和EEA-1共定位情况,结果显示干扰组EEA-1与GzmB共定位比对照组明显降低。2. NK92细胞内吞的GzmB可进入溶酶体Clathrin依赖的内吞途径包括从早期内体→晚期内体→溶酶体的全过程。免疫荧光检测靶细胞刺激60min后NK92细胞GzmB与lamp1共定位情况。结果显示,与未刺激组相比,GzmB与lamp1出现明显共定位;使用CPZ或siRNA后,共定位明显减少。GzmB与lamp1共定位提示GzmB进入溶酶体,且进入后并未被降解。为此,使用溶酶体酶抑制剂leupeptin处理NK92细胞,免疫荧光检测GzmB和lamp1共定位,结果显示共定位并未增加,提示GzmB在溶酶体内未被降解,可供分选重复利用。三、抑制NK92细胞内吞能显著降低杀伤靶细胞活性采用K562作为NK92细胞的靶细胞,CFSE-PI法在不同效靶比（2.5:1,5:1,10:1）条件下借助流式细胞术检测杀伤率。结果显示:相对于对照组,不同效靶比条件下经CPZ预处理的NK92细胞,其杀伤活性明显下降（16.93% vs 1.45% ,20.44% vs 1.69%,30.22% vs 2.79%）。应用siRNA干扰clathrin后,重复以上细胞毒性实验,得到相似结果,相比于对照组,不同效靶比条件下干扰组杀伤活性明显下降（23.18% vs 10.63% ,25.31% vs 13.02%,38.69% vs 15.51%）。四、NK92细胞杀伤靶细胞后上清及胞内GzmB水平检测为检测CPZ对NK92细胞胞吐后上清和细胞内颗粒酶B水平的影响,在10:1效靶比条件下,NK92细胞与K562作用1h、3h、5h,ELISA检测上清GzmB水平,Western-blot检测胞内GzmB水平。结果显示,随杀伤时间延长,对照组和CPZ处理组上清GzmB水平逐渐上升,与对照组相比,1h和5h组CPZ处理组上清GzmB水平略有上升（1.8ng/ml vs 2.0ng/ml,2.45ng/ml vs 2.8 ng/ml）,3h组GzmB水平有所下降（2.7ng/ml vs 2.25ng/ml）。相应各个时间点Western-blot检测胞内GzmB,杀伤后1h、3h、5h, CPZ预处理的NK92细胞内GzmB水平与对照组相比下降。五、结论1.靶细胞刺激下,NK92细胞出现胞吐及发生继发性内吞,内吞现象依赖于clathrin。2. NK92细胞继发性胞吞伴随效应分子GzmB回收。3. GzmB被NK92细胞回收,依次进入早期内体→晚期内体→lamp1⁺溶酶体→分泌型溶酶体,供再利用。4.抑制NK细胞内吞可显著降低NK细胞杀伤活性。第二部分IL-33与小鼠EAE发生的相关性及其机制多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）是以神经脱髓鞘为主要病理改变的中枢神经系统（CNS）炎症性疾病。用于研究MS的经典动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）。此模型通过主动免疫神经髓鞘来源的抗原或过继转移髓鞘特异性T细胞,诱导中枢神经系统炎症,其脱髓鞘和炎性细胞浸润等病理特征及疾病表现均类似于人MS,故被广泛应用于探讨MS发生、发展、转归、调控机制的研究。IL-33是近年新发现的IL-1家族成员,其基因序列和结构与IL-1家族成员IL-18和IL-1β相似。IL-33受体是孤儿受体ST2,亦称IL-1RL1。ST2基因主要编码两种形式的蛋白:膜结合型ST2和可溶性ST2。IL-33表达于人和小鼠多种组织,主要是上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞。IL-33具有重要免疫调节作用,并参与多种免疫相关疾病（如哮喘、类风湿关节炎、内毒性休克等）发生。IL-33主要介导Th2细胞应答,诱导Th2型细胞因子产生。文献已报道,中枢神经系统高表达IL-33。本课题主要观察正常小鼠和EAE小鼠中枢神经系统内IL-33表达、来源及其参与EAE发病的作用及机制。一、IL-33在小鼠中枢神经系统表达1. IL-33表达于正常小鼠中枢神经系统逆转录PCR、实时定量PCR、Western-blot检测正常C57BL/6小鼠脊髓、脑、皮肤、肺、肾脏、心脏、脾脏和肝脏组织IL-33表达;免疫荧光、免疫组织化学检测小鼠脊髓中IL-33表达。结果发现,在mRNA和蛋白水平,正常小鼠脑和脊髓IL-33表达水平远高于肝脏、脾脏等组织（约为12.5倍,P<0.01）。免疫荧光显示,正常小鼠脊髓高表达IL-33,主要定位于灰质,表达在细胞核内。免疫组织化学同样证明IL-33表达于细胞核内。Western-blot证明细胞核和细胞浆内均表达IL-33。2.脊髓中IL-33的细胞来源借助冰冻切片免疫荧光检测IL-33在正常小鼠脊髓的细胞定位,通过研究IL-33与星形胶质细胞标志物、神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、小胶质细胞标志物（CD68）、神经元特异性蛋白（NeuN）的组织共定位情况,确定IL-33在正常小鼠中的来源。结果显示,IL-33在体内与3种细胞标志物均未出现明显共定位,故暂时不能确定脊髓内IL-33的细胞来源。3.EAE小鼠脊髓内IL-33表达PCR、Western-blot和免疫组织化学检测正常小鼠和EAE小鼠脊髓IL-33表达,分别提取正常小鼠和EAE模型小鼠脊髓胞核、胞浆蛋白,Western-blot检测IL-33表达改变。结果显示,与正常小鼠相比,在mRNA和蛋白水平上,EAE动物体内IL-33表达量降低;免疫组织化学显示正常小鼠IL-33表达于细胞核内,而EAE动物IL-33表达于胞浆,提示EAE动物体内IL-33发生从胞核向胞浆的转位;Western-blot结果显示,正常小鼠IL-33表达于胞浆和胞核,EAE小鼠胞核不表达IL-33,胞浆中有表达。4. IL-33受体ST2在正常小鼠和EAE小鼠脊髓中表达免疫组化显示,正常小鼠ST2表达水平低,EAE小鼠ST2表达水平明显增高。二、IL-33参与小鼠EAE发生及其机制1. IL-33对小鼠EAE疾病进程的影响EAE小鼠于免疫前腹腔注射rIL-33（1μg /只）或发病后注射rIL-33（每天1μg /只,连续注射1周）。结果显示,注射rIL-33不影响小鼠EAE发病时间和疾病进程。2.抗IL-33多克隆抗体对EAE疾病的影响EAE小鼠于免疫前腹腔注射抗IL-33抗体（150μg/只）或发病后注射抗IL-33抗体（每隔3天150μg /只,连续注射5次）,结果发现:抗IL-33抗体可明显加重EAE疾病症状,EAE发病率升高,临床评分提高;两者发病时间相似;EAE小鼠脊髓冰冻切片免疫荧光检测显示,CD4⁺T细胞浸润增加。3.抗IL-33多克隆抗体可增强Th1和Th17细胞应答从注射抗IL-33抗体的EAE小鼠采集并分离脾脏细胞,体外用20μg/ml MOG_35-55抗原肽刺激淋巴细胞,72h后ELISA检测上清IFN-γ、IL-17、TNF-α水平,及脊髓组织IFN-γ、IL-17、TNF-αmRNA水平。结果显示,与对照组相比,上清内3种细胞因子水平和脊髓中3种细胞因子mRNA水平均明显升高。3.抗IL-33多抗明显降低脾脏、淋巴结CD11c+CD8α+DC数量,但不影响Treg数量体外取注射抗IL-33抗体的EAE小鼠脾脏和淋巴结细胞,流式细胞术检测CD11c⁺CD8α⁺DC数量,结果发现,注射抗体后CD11c⁺CD8α⁺DC数量显著下降,CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg数量未受影响。