背景和目的 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是具有增殖和自我更新能力的细胞，在一定条件下可诱导分化成神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞。近十年的研究表明，胚胎和成人脑组织中均存在神经干细胞，这为神经干细胞的移植治疗神经系统疾病提供了理论依据。当神经系统受到损伤时，神经干细胞可分化为有功能细胞进行补充，但是在一些神经系统退行性疾病如(Alzheimer disease，AD)中，这种补救机制似乎并未发生，神经细胞呈持续丢失状态。我们推测，这可能是由于AD病中脑内既有病变如高Aβ的微环境不利于神经干细胞的分化发育，或者在病理微环境下分化的神经细胞不能形成正常的结构和功能。 微管相关蛋白tau蛋白与神经细胞的结构和功能发挥关系密切。微管在维持神经元正常的细胞形态和细胞内部的细胞器、蛋白质的运输、信息传递等方面起着重要的作用，tau蛋白是微管结构维持和功能活动所必需的组分。tau蛋白在神经元中大量表达，主要定位于轴突，其主要作用是维持已形成的微管的稳定性，有助于微管的延长。 本实验室前期研究骨髓间质干细胞分化为神经细胞过程中，发现骨髓间质干细胞在形态上逐渐向神经细胞样改变后tau蛋白表达及其含量随神经细胞形态的形成而逐渐增加，提示由骨髓间质干细胞诱导分化的神经细胞发育过程中，需要大量的tau蛋白来促进微管的形成。也有研究表明，在神经干细胞定向分化过程中tau蛋白“从无到有”，Tau蛋白紧随微管的延伸，增加微管的稳定性，帮助微管在突起中伸展，确保突起正常生长，从而促进神经干细胞向神经元形态的转化。 正常Tau蛋白是一种磷酸蛋白，过度磷酸化可负调节Tau蛋白与微管结合的能力。正常磷酸化状态的tau蛋白有助于其功能的发挥，Tau发生高度磷酸化后，其促微管组装和维持微管结构的活性明显下降，导致神经原纤维的形态异常和轴浆转运障碍。但在神经干细胞分化为神经细胞过程中，关于Tau蛋白磷酸化的情况及是受调节程度还未见报道。本实验选取tau蛋白有一定代表性的两个磷酸化位点Tau[pS396]Tau[pS262]和磷酸化调节蛋白激酶GSK-3β，通过免疫细胞化学和蛋白印迹方法，在神经干细胞分化7天时检测的这两个位点的磷酸化情况，并用Aβ25-35和人参皂苷Rb1进行干预，探索新生神经细胞的Tau蛋白磷酸化水平的调节途径，从而为AD等疾病的发病机制和治疗途径提供理论和实验依据。 方法 无菌条件下自新生大鼠海马齿状回分离培养神经干细胞，将第三或第四代处于增值期的神经干细胞，体外培养并加血清及撤除有丝分裂原诱导分化，7天后分三组处理(1)正常组：不另加其它处理因素，继续培养36小时：(2)Aβ25-35处理组：继续培养24小时后加入凝聚态Aβ25-35(20μmol/L)作用于细胞12h：(3)人参皂苷Rb1预处理组：先加入人参皂苷Rb1(10μmol/L预处理24h,再加入凝聚态Aβ25-35(20μmol/L)作用于细胞12h。用免疫细胞化学和western-blot检测Tau[pS396]Tau[pS262]及GSK-3β[pTyr279，216]蛋白表达情况，数据记录采用X±S表示，采用SPSS12．0软件分析。组间比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 结果 1．Tau蛋白磷酸化状态的免疫细胞化学染色结果：对各组细胞爬片进行免疫细胞化学染色，在正常组神经干细胞分化过程中可检测到Tau[pS396]Tau[pS262]阳性表达的细胞，阳性率分别为12．6﹪和lO．6﹪。经Aβ25-35处理后，该组细胞的Tau[pS396]Tau[ps262]的表达明显增高，主要表现为细胞胞浆和轴突染色明显增浓，阳性细胞数增多，阳性细胞率较正常组显著升高(P<0.01)。但经人参皂苷Rb1预处理后再用Aβ25-35处理，该组的阳性细胞率虽然比正常组表达升高(P<0.01)，但增高水平低于Aβ25-35组(P<0.01)，阳性细胞主要表现为胞浆和轴突着色稍浓。 2．Tau蛋白磷酸化状态的蛋白免疫印迹结果：提取各组的细胞蛋白做蛋白免疫印迹，Ap处理组条带较正常组和人参皂萤Rb1预处理组点浓度高，而人参皂苷Rb1预处理组条带浓度较正常组高，统计结果显示，Tau[pS396],Tau[pS262]在各组之间均有显著性差异，各组两两比较也有统计学意义。 3．GSK-3β的蛋白免疫印迹结果：各组GSK-3β[pT279/216]蛋白条带浓度以Ap处理组最高，而人参皂苷Rbl预处理组条带浓度较正常组高，与各组tau蛋白磷酸化水平呈现一定相关性。 结论 1．神经干细胞分化过程中Tau蛋白具有一定程度的磷酸化水平。 2．在神经干细胞分化过程中，AB25-35可以通过激活GSK-3β诱导Tau蛋白过度磷酸化，人参皂苷Rbl可以抑制GSK-3β的活性，降低Tau蛋白磷酸化水平。