线粒体拥有自身的遗传物质,动物线粒体一般表现为严格的母系遗传,即标准线粒体遗传(Standard Mitochondrial Inheritance,SMI)。但近年来,研究发现在部分双壳贝类中存在着F型(female-transmitted,F-type)和M型(male-transmitted,M-type)2种类型的线粒体DNA(Mitochaondrial DNA,mt DNA),称为DUI(Double Uniparental Inheritance)。其中,M型仅存在于雄性个体的性腺中,而F型存在于雌性个体的性腺和体组织中以及雄性个体的体组织中。本研究对圆顶珠蚌(Unio douglasiae)和三角帆蚌(Hyropsis cumingii)这2种常见的淡水珍珠蚌的DUI现象开展了相关研究,不仅从mtDNA全序列的层面进行分析,并且根据mtDNA单基因的雌雄差异进行性别鉴定方面的应用,还通过对幼龄淡水蚌的性腺发育进行观察,进一步研究与DUI发生的关系。本研究首次获得了圆顶珠蚌F型和M型mtDNA全序列,2条mtDNA序列差异明显,证明在该蚌中存在DUI现象;结合圆顶珠蚌和三角帆蚌等共6种淡水蚌F型和M型mtDNA开展DUI现象的研究;此外,基于三角帆蚌F型和M型COII基因的特异性,根据其差异性扩增结果的检测,将其应用于对幼龄三角帆蚌性别鉴定的研究;并结合组织学切片观察幼龄三角帆蚌性腺组织发育,以探究dui发生与性腺发育的关系。具体研究内容如下:1.圆顶珠蚌f型和m型mtdna全序列比较分析本研究首次获得了圆顶珠蚌f型和m型mtdna全序列,两者长度分别为15767bp和16670bp,其中m型较f型长903bp。两者均包括13个蛋白质编码基因、22个trna、2个核糖体rrna和25个非编码区,f型和m型的非编码区长度分别介于1-312bp和1-348bp,并且两者最大非编码区的位置也不同。圆顶珠蚌f型和m型mtdna的coi-coiii、nd3-nd5、nd4l、atp6、atp8、trnaasp和trnahis在h链编码,其余在l链上编码。其m型mtdna的13个蛋白质基因总长比f型长出600bp。其中,在m型mtdna的coii基因3’端有一段长558bp的延伸片段。结构分析发现f型和m型coii基因在5’端的相近部位均有2个跨膜结构,而m型coii基因3’端还有另外4个跨膜结构,推测m型coii基因的延伸片段是有功能性的。2.淡水蚌dui现象比较分析结合圆顶珠蚌和三角帆蚌等共6种淡水蚌f型和m型mtdna全序列,对其全长及coi、coii和atp8的长度进行比较,发现f型和m型coi基因的长度相似;而coii基因序列的差异性极大,其中m型coii基因在3’端延伸出一段约500多bp的片段;除三角帆蚌m型atp8基因略长与f型外,其余均为f型略长。对比6种淡水蚌f型和m型mtdna的基因排列,发现在nd3-nd5之间存在部分trna排列顺序及数目的不同。其中,f型mtdna的排序皆为nd3→h→a?nd5→q→c,而m型皆为nd3→a→s?nd5→h→q→c。此外,比较发现f型和m型mtdna的13个蛋白编码基因的氨基酸序列发现也存在着明显差异,在这其中,f型和m型之间相似性低;各物种间f型序列较保守,m型序列突变性高于f型序列。其中coii、atp8这两个基因所编码的氨基酸序列差异最大;而coi基因最为保守,相似度最高。利用淡水蚌f型和m型mtdna的保守序列(coi和cytb基因),及高变异率序列(coii和atp8基因)所编码氨基酸的序列分别构建nj系统进化树。结果显示f型和m型mtdna明显分为2个支系,各物种f型聚于1支,而各物种m型聚于1支。这也进一步说明f型和m型序列间的差异大于物种间的遗传分化。3.三角帆蚌基于线粒体coii基因序列的幼龄性别鉴定本研究利用f型和m型线粒体coii基因的长度差异,将其作为一种分子标记,来检测f型和m型mtdna在3-10月的幼龄三角帆蚌中的存在。分别采集3月龄、4月龄、5月龄、5.5月龄、6月龄、6.5月龄、7月龄、7.5月龄、8月龄、9月龄和10月龄的三角帆蚌各20只,取其性腺及外套膜组织的基因组dna利用f型和m型特异性引物进行pcr扩增。结果显示,在3月龄时便可以检测出f型和m型coii基因的差异性扩增。其中,m型coii基因仅在部分幼蚌的性腺中可以检测出来,在外套膜中则检测不出;而f型coii基因在全体幼蚌的性腺和外套膜中均可以检测出来。在后续的4-10月龄幼蚌的检测中,也呈现同样的结果。研究表明,基于三角帆蚌的DUI现象,在3月龄阶段即可对幼蚌的性别进行鉴定,至于如何将检查方法有效应用到生产实践中还有待进一步实践摸索。4.幼龄三角帆蚌早期性腺组织发育的观察本研究对幼龄三角帆蚌性腺组织的发育进行研究,分别采集上述3-10月龄的三角帆蚌,根据性别鉴定结果采集各10只,取其性腺组织制作石蜡切片并进行HE染色。通过组织学切片观察三角帆蚌性腺组织发育,来初步探究DUI现象的发生与性腺发育的关系。结果显示,3-5月龄的幼蚌并不能观察到明显的性腺组织,消化管和大量的结缔组织充满了整个内脏团;5-8月龄的幼蚌,在内脏团中仍有大量的结缔组织,但是已经出现了少量的原始生殖细胞,外形尚不规则,很难辨别雌雄;8月龄开始的幼蚌性腺组织结构开始出现雌雄分化,雌雄基本可以进行辨认;此外,研究表明雄性性腺组织与雌性性腺组织相比,分化的更早,8月龄时已经可以非常清晰的辨认精母细胞。本研究首次扩增获得圆顶珠蚌的F型和M型mtDNA全长,为淡水蚌DUI研究丰富参考数据;并基于DUI现象对三角帆蚌的幼龄阶段的性别鉴定进行分析,通过组织切片观察性腺组织发育进程,以期为DUI现象在实际生产中的应用以及探究DUI发生和性腺发育提供基础资料。