向酒中添加酸性脲酶可以降低尿素含量,但是反应后酒中的游离酶难以分离、无法重复使用。将酸性脲酶制成固定化酶不但能避免以上的不足,而且可以扩大其使用范围。选取壳聚糖为主要固定化载体,分别采用壳聚糖-明胶复合固定化和壳聚糖纳米颗粒两种方式固定化酸性脲酶。其中,固定化酸性脲酶酶膜的最优条件为:采用质量浓度1.0%的壳聚糖和质量浓度为0.75%的明胶混合制膜,用质量浓度为0.02%的戊二醛交联,最适固定化时间为2 h,固定化酸性脲酶回收率为69.1%,固定化酶和游离酸性脲酶相比,能更好的耐受pH和温度变化,固定化酶的储存半衰期长达81 d,重复测定10次后其酶活力仍有91%。壳聚糖纳米颗粒固定化的最优条件是:用壳聚糖:多聚磷酸钠为5:3的比例,制得壳聚糖纳米颗粒,最适加酶量为1.5 mL时,酶活收率为81.7%,连续处理1 L黄酒之后,尿素去除率达到52.7%。从酶活力收率、制作流程、重复使用性和应用价值方面综合比较,选取壳聚糖-明胶膜复合固定化方法来固定化酸性脲酶。从糖类、多元醇类、无机盐类等几种保护剂中,选择对酸性脲酶有效果的保护剂,将其加入固定化酸性脲酶酶膜中考察效果。根据正交实验,最优保护剂组合为:蔗糖、甘油、NaCl的浓度分别为3.0 g/L、15%、15 mmol/L,在此条件下,单位固定化酸性脲酶酶膜面积酶活提高到0.68 U/cm2,储存半衰期延长到100 d,处理黄酒样品时较未加稳定剂的提高5个使用批次,使用半衰期有明显提高。将固定化酸性脲酶酶膜以卷式膜形式,放入层析柱中做成酶膜反应器,以0.5 mL/min的流速连续处理2 L黄酒时,黄酒中加酶量为0.08 U/mL,70 h后,黄酒中尿素去除率为54.8%,氨基甲酸乙酯含量降低率为55.6%,且未改变黄酒风味和黄酒中的多酚含量。将壳聚糖-明胶复合固定化方法应用于固定酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶,水解大豆分离蛋白,12 h后,水解度达32%。双酶固定化协同水解的酶解产物中,氨基氮含量提高1.84倍,总游离氨基酸含量提高2.12倍,水解液中大分子肽被分解。研究结果表明,这种壳聚糖-明胶膜复合固定化方法不仅适合于酸性脲酶的固定化应用,也可适合于最适pH在酸性或具备较宽最适pH范围的酶的固定化应用,以及同类酶的共固定使用。