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背景:在临床和科研工作中,人的血液和组织是比较容易获得的生物病理标本,适合临床和实验室检测以及生物样本库的采集和保存。DNA、RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子,在许多生理和病理过程中发挥着重要作用。高质量标本可满足RT-PCR、Northern blot、western blot、转录组测序、阵列分析等生物学实验研究需求。但由于RNA的结构特点和环境中核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）的广泛分布,RNA提取的质量受到样本类型、储存温度、储存时间等加工方法的影响,使得RNA的稳定保存相对困难。同时在生物学实验Western Blot中,前处理过程中会对蛋白质分子抗原性造成一定的损伤并间接可能造成一定量的实验信息的丢失和错误,因此本课题我们主要研究在生物学实验过程中影响RNA及蛋白质稳定性的影响因素及进行定量解析,并试图寻找解决方案。方法:1.倍比稀释法对测量体系进行精密度检测,探索RNA提取前后相关实验操作对RNA降解的影响,其中我们采用正交试验设计对m RNA在标本中降解和实验过程中降解进行定量分析。2.将新鲜抗凝血液标本在室温下放置不同时间后分别进行RNA提取,用实时荧光定量PCR扩增出不同RNA的五种基因,并根据Ct值建立半衰期线性模型。观察四种RNA各自的降解情况及半衰期长短。3.将从新鲜抗凝血液标本中提取的RNA于室温下放置,进行倍比稀释后每隔12h进行实时荧光定量PCR扩增,利用机器学习方法在基于相关度、相对错误或已用变量数下对模型进行对比,选用拟合度最高的模型来预测室温放置下RNA的降解速率。4.对低温冻存时间、冻融次数、冻融方式等因素对RNA等相关分子的影响进行探索。5.新型RNA稳定剂的初步研究,将提取出的RNA溶液分别与生理盐水、50%的甘油、100%甘油、50%二甲基亚砜、100%二甲基亚砜、RNA稳定剂进行混合,各分装到两个EP管中,一份立即进行q PCR检测,另一份放置-70℃冰箱中进行冻存,放置72h后进行检测,通过使用实时荧光定量PCR进行检测,我们比较了使用这些试剂存储的RNA与未使用的RNA在-70℃冰箱中存储的浓度质量的差异。6.对乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBs Ag）阳性血清在不同的温度下加入不同剂量的SDS、β-巯基乙醇将抗原进行变性处理,这是western blot所需要的预处理。对照组加等量的生理盐水,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）和双向免疫扩散实验两种免疫学方法对实验组和对照组的抗原进行定性及定量分析。7.选择月桂醇肌氨酸钠（sarkosyl）作为SDS的替代试剂。在单因素处理组中,以与SDS相同的浓度加入sarkosyl,处理方法与SDS相同。采用酶联免疫吸附试验和双向免疫扩散试验观察蛋白抗原性的变化。结果:1.检测体系具有良好的精密度,后续实验基于以上实验仪器得出的实验结果较为可靠。线性回归结果显示血液标本室温放置时间这个因素对RNA降解的影响最大,经过计算m RNA的半衰期为16.4h。Circ RNA、lnc RNA及mi RNA的半衰期分别为24.56±5.2h、17.46±3.0h及16.42±4.2h。2.我们使用拟合度最高的神经网络模型,利用放置时间、稀释倍数及扩增循环值三者构建模型模拟计算出了“最低初始检测物质量”对四种RNA的稳定性进行了评估。3.在相同放置时间下,冻融次数越多,基因扩增的Ct值越大,表明冻融次数的增加会加速RNA的降解。且不同的冻融方式对RNA的降解速度亦有明显影响,冻存方式效果较好的为慢冻速溶组及速冻慢溶组,明显优于速冻速溶组。4.在RNA稳定剂的探索中我们发现甘油和二甲基亚砜对RNA具有较好的保护作用,保护效果优于购买的RNA稳定剂。5.对照组在37℃时的HBs Ag滴度为1:512。用SDS在100℃沸水孵育下可将抗原滴度降低到1:32。在100℃SDS和2-巯基乙醇同时作用下,对HBs Ag滴度的抑制效果达到96.9%。6.SDS替代试验:37℃单因素组,SDS组随SDS浓度增加吸光度值分别为0.866、0.333和0.297;sarkosyl组的值分别为1.086、0.474和0.316,37℃下对照组的吸光度值为1.650。在双向免疫扩散实验中:37℃下SDS组与sarkosyl组的抗原滴度均分别为1:256、1:256和1:64,两者并无差别。结论:1.室温放置对RNA降解的影响较大。mi RNA半衰期略长于m RNA,但基本相似。m RNA相关的定量实验应在2h内完成。Circ RNA、lnc RNA的半衰期较前两者长。然而我们发现扩增片段的长度和稳定性之间似乎没有关系,因为即使扩增片段的长度相似,它们的半衰期仍然非常不同。2.在实验过程中,我们应尽量减少标本在冰箱里的冻存时间。在冻融方式上,与细胞复苏过程类似的速冻慢溶组方式较好。甘油和DMSO对RNA稳定性具有一定的保护作用。3.SDS和2-巯基乙醇对抗原有较强的抑制作用。对这些试剂抵抗力较弱的抗原在进行蛋白免疫印迹时可能会产生假阴性结果。