论文部分内容阅读
目的:(1)了解2013-2018年舟山海岛地区急性胃肠炎散发人群中诺如病毒流行病学特征,基因型别分布以及优势流行株的动态变化。(2)了解舟山海岛地区GII.P16-GII.2及GII.P17-GII.17型诺如病毒的基因特征,进化历程以及时空传播动态。方法:(1)收集2013-2018年舟山医院肠道门诊中符合病毒性腹泻诊断标准的患者粪便或肛拭子样本1849份及腹泻个案调查表。(2)对采集的样本采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(Realtime Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)检测诺如病毒,并结合调查资料对诺如病毒的流行特征进行分析。采用逆转录聚合酶链式反应法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)对诺如病毒阳性样本进行扩增,将阳性产物进行测序并对序列进行基因分型及使用MEGA构建系统进化树,从分子水平分析舟山海岛地区急性胃肠炎散发人群中诺如病毒毒株流行状况,基因型别分布以及优势流行株的动态变化。(3)使用RT-PCR法对舟山海岛地区的主要流行株GII.P17-GII.17以及GII.P16-GII.2型诺如病毒扩增近乎完整的VP1区以及GII.P16RdRp区,将阳性产物进行测序并使用Simplot识别不用亚型之间的重组事件;使用RAxML软件采用最大似然法(Maximum-likelihood,ML)构建ML树;使用MEGA软件测量不同进化簇之间的平均氨基酸距离,最后使用BEAST v.1.8.2软件中贝叶斯一马尔科夫链一蒙特卡洛(MCMC)方法以及贝叶斯随机变量搜索模型(BSSVS)对舟山海岛地区GII.P16-GII.2以及GII.P17-GII.17进行分子进化,谱系地理发生学分析。结果:(1)2013.01-2018.08共收集舟山医院急性胃肠炎患者粪便或肛拭子样本1849份,其中诺如病毒阳性样本134份,GII型阳性120份(89.55%),GI型阳性14份(10.55%),男女比例为1.65:1,年平均阳性率7.24%,阳性率呈现逐年上升趋势(?2trend=22.72,P<0.05),年龄组以15-40岁组阳性率最高为11.00%,月份以12月-4月阳性率最高为18.62%,发病高峰在4月份。共检测出16种诺如病毒基因型,GII型诺如病毒10种,GI型诺如病毒6种。前三位基因型为GII.P17-GII.17(38.75%),GII.Pe-GII.4Sydney2012(18.03%),GII.P16-GII.2(17.12%),不同基因型别年龄组间分布差异具有统计学意义(?2=17.34,P=0.008<0.05)。2013-2014以GII.Pe-GII.4Sydney2012为主要流行株,2015-2016年GII.P17-GII.17为绝对优势流行株,2017-2018年以GII.P16-GII.2和GII.P17-GII.17伴随交替流行。(2)Simplot分析结果显示,舟山海岛GII.P16-GII.2型诺如病毒由GII.P16RdRp区以及GII.2VP1区重组而成,重组位点位于ORF1-ORF2连接区5052-5053bp处,GII.P16可以分为a,b,c三簇,其中舟山海岛GII.P16型隶属于GII.P16c簇。对GII.P16型诺如病毒进化分析显示其进化速率为2.64×10-3(2.17–3.08×10-3)替代/位点/年,推算GII.P16型诺如病毒的最近共同祖先(The Most Recent Common Ancestor,TMRCA)出现在1983(1978-1989)年,2016-2017年浮现并流行的新GII.P16c簇由2012-2013分化自2010-2012年日本GII.P16-GII.2毒株。GII.2可以分为a,b,c,d四簇,舟山海岛GII.2型隶属于GII.2d簇。对GII.2型诺如病毒的谱系地理发生学结果显示,其进化速率为3.36×10-3(2.66–4.04×10-3)替代/位点/年,推算GII.2型诺如病毒的TMRCA出现在1967(1957-1975)年,2016-2017年浮现并流行的新GII.2d簇由2012-2013分化自2010-2012年日本GII.P16-GII.2毒株。BSSVS模型显示新重组GII.P16-GII.2在2012-2013传入我国香港,随后香港成为我国GII.P16-GII.2型诺如病毒暴发的中心,主要向沿海城市传播,舟山海岛地区GII.P16-GII.2型诺如病毒最可能出现在2016年,由香港-江苏-舟山海岛的路径传入。(3)ML树结果显示GII.P17-GII.17型诺如病毒分为A,B,C,D四簇,舟山海岛地区主要流行的GII.P17-GII.17型诺如病毒隶属于D簇。对舟山海岛地区31条GII.P17-GII.17 VP1序列进化分析结果表明,其在本区域内进化速率为1.14×10-3(0.62–1.73×10-3)替代/位点/年,TMRCA出现在1997(1987-2009)年,2014-2015年出现的新变异GII.P17-GII.17型诺如病毒TMRCA出现在2011(2009-2012)。对GII.17型诺如病毒的谱系地理发生学结果显示,香港是这次新变异GII.P17-GII.17型诺如病毒暴发的中心,BSSVS模型舟山海岛地区GII.P17-GII.17型诺如病毒最可能由香港以及日本传入。结论:2013-2018年舟山海岛地区急性胃肠炎散发人群中诺如病毒年平均阳性率为7.24%,阳性率呈现逐年上升趋势,本区域内诺如病毒共检出10种GII基因型,6种GI基因型,优势流行株轮转频繁,基因型别分布复杂,我国浮现的诺如病毒新变异株常以香港为暴发流行中心,继而向国内其他区域传播。