手足口病是儿童流行疾病中比较常见的疾病之一,许多种肠道病毒都可以引起手足口病,近几年来在我国以肠道病毒71型(EV71)为主要的病原体。自1997年以来,EV71病毒的流行在亚太地区呈现上升的趋势,甚至引起了严重的中枢神经系统的感染或死亡,引起了人们的密切关注。由于目前还没有针对EV71病毒的特效药和疫苗,因此,研发一种能有效控制EV71病毒流行的疫苗已经势在必行。本研究的目的是为建立纯化EV71病毒工艺,为以后制备EV71病毒的疫苗提供可靠的研究数据。本研究以EV71病毒粗提液做为研究的材料,建立了凝胶过滤层析和离子交换层析相结合的纯化工艺,为EV71病毒纯度的提高提供了最佳的层析参数。首先,对Sepharose 4 Fast Flow凝胶过滤层析参数的筛选,选用不同的洗脱流速、不同的样品上样量、不同缓冲溶液的pH值和不同盐浓度对EV71病毒粗提液进行连续洗脱。结果表明凝胶过滤层析的洗脱流速、样品上样量、缓冲溶液的pH值和盐浓度对EV71病毒均能不同程度地影响EV71病毒的分粗提液的分离效果。在实验范围内,选择洗脱流速为60cm/h、样品的上样量为5%CV、缓冲溶液的pH值为7.5和盐浓度为0.1mol/L时,对EV71病毒原液的分离效果比较理想。接着选用了Q Sepharose XL阴离子胶作为层析介质来纯化EV71病毒原液。影响离子交换层析的因素有离子强度、pH、温度和流速等,本文主要探讨了离子强度和pH对离子交换制备EV71病毒的影响。先采用线性梯度洗脱法,初步筛选制备EV71病毒平衡缓冲液含氯化钠的浓度范围和洗脱缓冲液中氯化钠的浓度;然后在同一pH条件下,改变平衡缓冲液中氯化钠的含量,计算在每种平衡缓冲液下EV71病毒的效价和滴度,选择最佳的平衡缓冲液的氯化钠的含量;再在同一离子强度条件下,改变pH值,通过计算EV71病毒的效价和滴度,选择最佳pH值。最后通过正交法去验证了不同离子强度和pH值组合,从而筛选出了最佳层析参数。本实验可以看出离子强度和pH值均能不同程度地影响EV71病毒的制备。在实验范围内,平衡缓冲液中含200mmol/L氯化钠和pH为7.5为最佳组合。最后采用先凝胶过滤层析后离子交换层析相结合的方法,运用前面筛选的最佳层析参数,进行实验,得到了制备高纯度的EV71病毒的可行性,获得了满意的结果。该工艺简单、成本低、效价和比活高。