氟对小鼠睾丸中IL-17A及其信号通路的影响

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[目的]多年以来,大量的实验研究表明,氟对雄性生殖系统的损伤是多方面的。本实验旨在探讨氟对小鼠睾丸中IL-17A及其信号通路的影响,并初步检测了 IL-17A及其信号通路调控的相关基因和蛋白的变化,为进一步探讨氟致雄性生殖系统的生殖毒性机理和实施科学靶标药物设计思路提供理论依据。[方法]选用103只8周龄雄性BALB/c小鼠,随机分成5组,分别为对照组、低氟组、中氟组、高氟组和自身免疫性睾丸炎组(EAO),每组各20只,剩余3只用做睾丸匀浆。采用饮水摄氟的方法,对照组和EAO组均给予去离子水,其余三组攻氟组分别给予含25、50以及100mg/L NaF的去离子水;EAO组采用皮下注射睾丸匀浆的方法进行诱导构造模型。在整个实验过程中,各实验组都保证其自由采食和自由饮水。150d后,断颈法处死小鼠,取其睾丸、附睾、精液、股骨及其各脏器组织,一部分睾丸用Bouin’s试剂进行固定,另一部分睾丸撕膜后立即分离睾丸间质组织液和睾丸间质组织细胞,进行相关指标检测,分别采用氟离子选择电极法测定骨氟含量,HE染色法观察EAO组睾丸组织的形态结构变化,酶联免疫吸附测定试验(ELISA)、免疫组化(Immunohistochemistry)技术和Real-time-PCR方法检测IL-17A及其信号通路调控的相关基因及蛋白的表达量变化。[结果]1.与对照组相比,各氟组股骨氟含量均明显升高,低氟组、中氟组和高氟组差异极显著(P<0.01)。2.EAO组睾丸组织的HE染色结果显示,对照组小鼠睾丸中生精上皮排列有序而紧密,在睾丸组织的小间隙区域几乎看不到炎症细胞的存在,曲细精管的官腔中无细胞脱落且管腔内充满精子;与对照组相比,EAO组中生精上皮排列紊乱而松散,且形成了很多空泡,在睾丸小间隙中出现炎性细胞,甚有部分生殖细胞脱落至官腔内。3.与对照组相比,各氟组中主要脏器系数均无显著性差异,在EAO组中,睾丸的脏器比显著下降(P<0.01),附睾的脏器比显著升高(P<0.05),脾脏和肝脏的脏器比显著上升(P<0.01),心脏和肾脏脏器比无显著差异;精子活力、精子活率及精子密度在各实验组均呈下降趋势,精子活力、活率在中氟组显著下降(P<0.05),在高氟组极显著下降(P<0.01),在EAO组极显著下降(P<0.01),精子密度在高氟组显著降低(P<0.05),在EAO组极显著下降(P<0.01)。4.与对照组相比,ELISA结果显示在高氟组和EAO组,小鼠睾丸间质组织液中IL-17A的含量均显著升高(P<0.05)。经统计发现,各氟组中小鼠股氟含量与睾丸间质组织液中IL-17A的含量之间呈线性相关且线性决定系数R2 =0.5090。5.与对照组相比,IHC的结果表示IIL-17RA和IL-17RC蛋白主要表达的部位在睾丸组织的小间隙和生精上皮,且通过统计光密度值得出,与对照组相比,IL-17RA和IL-17RC的蛋白表达量呈升高的趋势,且在中氟组差异显著(P<0.05),在高氟组和EAO组差异极显著(P<0.01)。6.qRT-PCR方法检测小鼠睾丸间质组织细胞中IL-17信号通路相关基因的表达,结果显示,与对照组相比,高氟组和EAO组中IL-17A,IL-17RA和IL-17RC的mRNA表达量均呈升高趋势,且IL-17A,IL-17RA和IL-17RC的mRNA表达在高氟组内显著升高(P<0.05,P<0.01),在 EAO 组中 IL-17A,IL-17RA 和 IL-17RC 的 mRNA 表达量也显著升高(P<0.01)。由Act1介导的MAPKs通路,Act1的mRNA表达量在高氟组和EAO组显著升高(P<0.05,P<0.01);TRAF6的mRNA表达量呈升高趋势,但无显著性。在ERK通路中,与对照组相比,ERK2和ERK5的mRNA表达水平均呈下降趁势,且ERK2的mRNA表达量在中氟组差异显著(P<0.05),ERK2和ERK5的mRNA表达量在中氟组和高氟组差异极显著(P<0.01),在EAO组中均无显著变化,而ERK1在各组中差异都不显著;JNK通路中,与对照组相比,JNK1和JNK3的mRNA表达量在高氟组显著升高(P<0.05),在EAO组中无显著差异,相反JNK2的mRNA表达量在EAO组中显著升高且差异非常显著(P<0.01),在各氟组中无显著变化,;在P38通路中,P38MAPK的mRNA表达量在EAO组显著升高且差异极显著(P<0.01),在各氟组中均无显著变化。由Act1介导的NFκB通路中TAK1虽有一定的变化趋势,但均无显著性差异。由Act1介导的C/EBP通路中C/EBP的mRNA表达量在EAO组中显著升高,且差异极显著(P<0.01)。[结论]本实验结果表明,在氟作用下,小鼠睾丸间质中炎症因子IL-17A的水平显著升高,且通过进一步检测IL-17信号通路上相关基因的表达水平,其中IL-17介导的Act1-MAPK通路的相关基因发生了显著性变化,这说明在基因水平上,氟引起睾丸的免疫应答可能是通过介导IL-17信号通路中Act1-MAPK通路的相互作用来完成的。
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