研究表明,食物中的生物活性物质,如白藜芦醇、番茄红素、儿茶素、槲皮素、多糖类、肽类物质等均可显著改善乙醇对机体的损伤。细胞学方法因具有可模拟体内生理环境、实验周期较短、成本较低等优势广泛应用于抗乙醇损伤活性物质的评价。但传统的细胞学方法检测指标有限,无法对复杂的活性物质作用机制及活性强弱进行全面准确评价。细胞代谢组学以细胞代谢物为研究对象,可以反映扰动状态下细胞表型和细胞活动。运用细胞代谢组学方法,有望建立一种新的抗乙醇损伤活性评价方法,通过分析活性物质干预后细胞代谢物的变化对活性强弱进行全面分析及评价。本研究采用细胞代谢组学研究方法,以L-02细胞为研究对象,基于HPLC-MS技术平台,通过对干预前后胞内代谢物的分析,结合多种模式识别技术,获取与乙醇诱导肝细胞损伤相关的生物标志物,构建基于细胞代谢组学的抗乙醇损伤活性评价方法,并应用该方法评价油橄榄叶提取物活性。主要研究内容如下:(1)乙醇诱导肝细胞损伤生物标志物的发现。首先通过MTT及ROS实验筛选乙醇及VC作用浓度及作用时间,采用HPLC-DAD对各组细胞代谢物进行分析,选取33个共有峰进行PCA、OPLS-DA模式识别分析,获取与乙醇损伤相关的14个代谢物靶标。经对照品保留时间、加标法、LC-MS等方法对14个潜在生物标志物进行比对,最终确认8种潜在生物标志物,分别为:苹果酸、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、ATP、苯丙氨酸、AMP、硝基酪氨酸、色氨酸。(2)基于细胞代谢组学的抗乙醇损伤活性评价方法的建立。以L-02细胞为研究对象,以VC为标准物质,通过预先加入不同浓度VC干预后对细胞进行乙醇损伤,对细胞代谢物进行HPLC分析,以前期筛选的潜在生物标志物为变量,在对照组与模型组的OPLS-DA模型基础上,对不同浓度VC组进行得分散点分布及Y值预测,进而得到不同浓度VC抗乙醇损伤活性的定性及定量结果,建立VC浓度与Y预测值的回归方程,将1μg/m L VC的活性能力定义为一个活性单位,建立基于细胞代谢组学的抗乙醇损伤活性评价方法。(3)基于细胞代谢组学的抗乙醇损伤活性评价方法的应用。(1)对19个品种油橄榄叶8种营养成分及3种活性成分含量进行测定,并运用聚类分析及主成分分析两种模式识别方法对结果进行分析,结果表明膳食纤维、还原糖、橄榄苦苷是油橄榄叶的特征成分,与油橄榄叶品质密切相关,并将其分为3类,即高膳食纤维+低橄榄苦苷+低还原糖、中膳食纤维+高橄榄苦苷+高还原糖、低膳食纤维+中橄榄苦苷+高还原糖。(2)采用建立的基于细胞代谢组学的抗乙醇损伤活性评价方法评价不同部位油橄榄叶提取物活性。首先通过MTT实验筛选不同油橄榄叶提取物作用浓度,对油橄榄叶提取物干预后的不同组细胞代谢物进行HPLC分析,将不同提取物的Y预测值带入方程后,得到其抗乙醇损伤活性值,评价结果显示油橄榄叶提取物不同部位均具有一定的活性,活性顺序为乙酸乙酯相>水相,OP相>Q相>E相>GHI相。