白僵菌Beauveria bassiana是当前世界上研究和应用最多的一种广谱虫生真菌,其致病力强,杀虫谱广,对温血动物无害且容易培养,在我国应用白僵菌防治农、林害虫的种类和面积均居世界首位。然而在研究和应用过程中,菌株继代培养一定代数后经常出现生产性状的退化,如产孢量减少、杀虫毒力降低等,严重影响了应用白僵菌进行害虫生物防治的应用效果。菌种退化问题一直是困扰着微生物学工作者的难题,也是许多科研工作者多年来致力于解决的问题。通常科研工作者只是从菌种保藏方法和培养条件的改善、控制传代次数、人工强制形成异核体、筛选稳定的高毒力单孢株等方面去控制菌株的退化速度,并未从根本上解决问题。而菌种变异主要是由于遗传本质决定的,最有效的调控措施是采取生物工程技术。为弄清白僵菌菌株退化的遗传学机理,有效控制其退化,本研究以桑天牛幼虫高致病性白僵菌菌株为材料,采用RAPD技术对正常菌株和退化菌株之间的遗传变异进行初步探索。主要研究结果如下:1.对实验室保存的菌种Bb00菌株进行复壮和传代培养。结果表明菌株在寄主体内复壮三次以后,产孢量明显增加,菌丝生长速率明显比复壮前小。传代培养得到20代菌株,随着传代次数的增加,菌丝生长速率逐渐增大,菌株的产孢量越来越低,宏观上表现出生物学性状的退化。2.对20代退化菌株进行生长速率、产孢量测定,结果表明:随着传代次数的增加,菌丝的日生长速率逐渐增大。第13代菌落生长速率突然增加并且在14天时的生长量达到最大值。14d时菌落直径达到8厘米以上的菌株为11-15、17、19、20代。产孢量的测定结果表明,传代次数越多的菌株产孢能力越小,孢子层较薄,第1代菌株的产孢量最多,为2.64×108 /cm2,第20代产孢量最少,为0.61×108/cm2。3.不同传代次数菌株对桑天牛幼虫的致病力研究表明:不同传代次数的菌株对桑天牛幼虫均有一定的致病力,但侵染率不同。随着传代次数的增加,对桑天牛幼虫的致病力逐渐减小。接种7d后第一代菌株的致死率最大,达到91.46%,而第20代菌株的致死率则为26.83%。4.RAPD-PCR反应体系优化研究,通过采用L16(45)正交试验及退火温度和循环次数的单因素优化,对反应体系中的各因素进行优化组合。结果表明,20uL PCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer 2μL,MgCl2(25mmol/L)2.4uL,四种dNTP(各2.5mmol/L)0.8uL ,随机引物(10μmol/L)1.4uL , TaqDNA聚合酶(5U/uL)0.4uL,模板DNA (10 ng/uL)1uL。反应条件为94℃预变性2min,94℃变性30 s,38℃退火40 s,72℃延伸1min,循环次数40次,72℃延伸5min。5.退化菌株DNA多态性的RAPD分析。通过相似率公式计算出各代菌株的相似率为:1代和6代之间的相似率最大为94.86%,1代和12代之间的相似率最小为42.04%,1代和14代、16代、18代、20代的相似率在70%以上,说明菌株在6代之前基因组几乎没有变异,12代菌株基因突变最大,菌株继代12次时基因组DNA已经发生了改变。