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【背景与目的】近年来慢性骨髓增殖性肿瘤(MPN)发病机制的研究取得了重要进展,2005年几个研究小组几乎同时发现,MPN患者造血细胞信号传导分子JAK2基因第1849位鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取替,导致JAK2激酶617位缬氨酸(V)错义编码为苯丙氨酸(JAK2V617F),使JAK2分子得到持续活化,此改变可能与MPN的发病有密切的关联,并发现在绝大多数真性红细胞增多症(PV)患者和半数左右原发性血小板增多症(ET)患者及原发性骨髓纤维化(MF)患者中能检测到此突变,而在骨髓增生异常综合症、急性白血病患者中偶尔也能检测到此突变。随着研究的深入,发现此突变有两种类型——纯合型突变和杂合型突变,并发现突变型JAK2V617F与野生型JAK2基因的比例决定MPN的表型。因此,对JAK2V617F突变的研究有利于MPN的诊断,判定疾病的预后和未来靶向治疗靶点的选择,成为MPN研究的热点。近年国内对JAK2V617F突变的研究主要集中于临床检测,未能做到对此突变的进一步基因分型和相对定量研究,针对此我们研究了中国人MPN患者和急性白血病M2型患者中JAK2V617F突变的发病率、基因分型、相对定量情况和临床资料间的关系,总结如下。【方法】第一部分第一章选取2005年8月～2008年10月我院门诊就诊MPN患者,按照2001年WHO分类诊断标准选择患者,采集患者外周血5ml,Ficoll-paque分离单个核细胞,运用基因组DNA抽提试剂盒进行DNA的抽提,采用等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)扩增JAK2基因,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,筛选出突变阳性患者PCR产物进行测序证实,收集患者的临床资料、染色体结果及随访结果。第一部分第二章选取2006年1月到2008年6月间到我院就诊的急性白血病M2型患者及部分我所冻存标本作为研究对象,按照《血液学诊断及疗效标准》选择患者,收集患者的临床资料,采集患者的外周血,运用AS-PCR(同第一部分第一章)扩增JAK2基因,并结合临床资料进行研究。第二部分和第三部分选取2006年1月到2008年6月间到我院就诊的MPN患者及部分我所冻存标本作为研究对象,按照2001年世界卫生组织(WHO)慢性骨髓增殖性疾病诊断标准选择患者,采集患者外周血10ml,Ficoll-paque分离单个核细胞,Trizol一步法抽提总RNA,应用鼠源逆转录酶将RNA逆转录为互补cDNA,采用ARMS(Amplification-refractory muration sequencing)-PCR技术扩增JAK2基因,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行基因分型,筛选出突变阳性患者PCR产物进行测序证实,并经毛细管电泳进行JAK2V617F突变转录本水平的相对定量分析,染色体检查按照常规R显带技术进行,同时分析检测结果与临床间的关系。【结果】1.运用AS-PCR方法检测了412例MPN患者,根据检测结果结合临床资料显示:共发现277例患者JAK2V617F突变阳性,JAK2V617F突变在原发性血小板增多症(ET)、特发性骨髓纤维化(IMF)及不能分类的骨髓增殖性疾病(MPD-U)中发生率分别为55.9%、66.7%和52.4%,差异无统计学意义(P＞0.05),但均较真性红细胞增多症(PV)中JAK2V617F发生率(95.6%)为低(P＜0.05);JAK2突变型患者的平均年龄高于野生型患者(P＜0.01);JAK2V617F阳性组的白细胞水平及血红蛋白水平均较JAK2V617F阴性组为高(P＜0.05);JAK2V617F阳性组中血管事件发生率高于阴性组(P＜0.05);具有JAK2V617F阳性的MPD-U患者较阴性MPD-U患者更易进展为典型MPN(P＜0.05);301例进行过染色体检查的患者中,18例存在核型异常,未发现核型异常与JAK2V617F突变之间存在相关性。2.运用AS-PCR方法检测了80例AML-M2患者,根据检测结果结合临床资料显示:80例AML-M2患者中共发现JAK2V617F阳性7例,6例为初诊患者,1例为复发患者,总阳性率8.8%:7例JAK2V617F阳性AML-M2患者形态学上血象、骨髓象呈现出白血病改变特征,并无骨髓增殖性疾病(MPD)症象,免疫分型显示为髓系表达;本院治疗5例JAK2V617F阳性AML-M2患者,4例经2疗程诱导治疗达完全缓解(CR),1例未缓解(NR);5例JAK2V617F阳性AML-M2患者,除1例失访外,其余4例总生存期(OS)中位值为18.5个月。3.运用ARMS-PCR联合毛细管电泳检测123例MPN患者,结果显示:JAK2V617F阳性90例,其中35例真性红细胞增多症(PV)患者中JAK2V617F阳性35例,阳性率100%(35/35),85例原发性血小板增多症(ET)患者中JAK2V617F阳性53例,阳性率62.4%(53/85),低于PV患者,差别有显著性(P＜0.05);3例慢性骨髓纤维化(IMF)患者中JAK2V617F阳性2例,阳性率66.7%(2/3)。90例JAK2V617F突变患者中共检出纯合突变35例,其中PV患者17例(17/35)占48.6%,ET患者17例(17/85)占20%,低于PV患者,差别有显著性(P＜0.05),IMF患者1例;90例毛细管电泳定量分析显示,35例纯合型突变患者JAK2V617F突变转录本水平为(89.5±6.5)%,55例杂合型突变患者JAK2V617F突变转录本水平为(57.9±6.7)%,较纯合型突变患者为低,差别有显著性(P＜0.05);杂合型PV患者JAK2V617F突变转录本水平为(63.7±6.3)%,高于杂和型ET患者的(54.4±6.1)%,差别有显著性(P＜0.05)。93例患者进行了染色体检查,6例有核型异常,但未发现特异性染色体改变。4.运用ARMS-PCR联合毛细管电泳检测了131例MPN患者,根据检测结果结合临床资料显示:纯合型JAK2V617F突变ET患者和杂合型JAK2V617F突变ET患者其发病年龄均较野生型患者为高(P＜0.05);MPN患者中年龄与JAK2V617F突变的发生间存在相关性(P＜0.05),≥60岁患者JAK2V617F突变转录本水平高于＜60岁患者(P＜0.05);JAK2V617F突变阳性MPN患者(PV和ET)白细胞和血红蛋白水平均高于阴性患者(P＜0.05),ET患者中纯合型突变者白细胞水平高于杂合型突变者(P＜0.05);JAK2V617F突变在PV中的发生率和JAK2V617F纯合型突变在PV中的发生率均较JAK2V617F突变在ET中的发生率和JAK2V617F纯合型突变在ET中的发生率为高(P＜0.05);JAK2V617F转录本水平均值在PV、ET和IMF患者中无差别。5.运用ARMS-PCR联合毛细管电泳检测了105例MPN患者,根据检测结果结合临床资料显示:有血栓PV、ET患者年龄、WBC数高于无血栓患者(F＜0.05),WBC≥15×10~9/LET患者血栓发生率高于WBC＜15×10~9/L患者(P＜0.05),JAK2V617F阳性患者血栓发生率高于阴性患者(P＜0.05),有血栓事件者JAK2V617F转录本水平高于无血栓事件者(P＜0.05),JAK2V617F阳性患者血栓事件风险度高于JAK2V617F阴性患者(OR=11.30),突变转录本水平在(60-100)%组患者血栓事件风险度高于JAK2V617F阴性组患者(OR=31.5)。【结论】1.JAK2V617F突变与MPN患者年龄、外周血细胞计数及血管事件之间存在关联性,JAK2V617F的检测对判定MPN-U患者疾病转归有提示作用。2.作为AML发病机制中的Ⅰ类改变JAK2V617F突变可能并非是AML发病的初始事件,而是其发病的额外事件,初诊AML患者出现此改变也并非意味着疾病预后较差。3.ARMS-PCR可作为JAK2V617突变分型较准确的检测方法,结合毛细管电泳可用于此突变的相对定量分析。4.ARMS-PCR结合毛细管电泳定性和定量分析JAK2V617F突变可用于MPN的诊断、预后判定和微小残留病的检测。5.高龄、白细胞计数增高,JAK2V617F突变及高转录本水平MPN患者血栓风险可能较高。