黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制

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刺参富含刺参粘多糖、蛋白质、氨基酸、刺参皂苷等营养,由于其较高的经济价值与营养价值,我国刺参养殖规模增长迅速,但是养殖模式的不够成熟及生产过程中的不规范操作,刺参病害问题日渐突出,其中由细菌感染引起的化皮病是当前养殖刺参中最常见、危害最为严重的疾病。该病存在明显的病原多样性和地区差异,黄海希瓦氏菌(Shewanella smarflavi)是引起辽宁刺参化皮病的重要病原菌,导致养殖过程中刺参大量死亡,造成巨大的经济损失,严重危害刺参养殖业的发展。水产养殖中针对水生动物疾病的爆发无非就是要做到快速、准确的诊断,而通常病原菌引起大规模疾病的爆发都有一段潜伏期,在这段时间内,动物本体往往没有太明显的症状,这就造成了疾病确诊的延误,从而耽误了疾病治疗的最佳时机。目前针对黄海希瓦氏菌检测的生理生化方法、分子生物学鉴定法及ELISA法都不同程度需要专业操作技术人员且耗时过久,在基层无法操作检测,为了达到疾病早期确诊,这就要求一种快速、简便、准确的检测方法。胶体金免疫层析技术(GICA)是一种以胶体金为标记物的快速免疫结合分析技术,通过该技术建立的试纸条是一种新型体外检测工具,具有简便快速、肉眼判断、放大反应等优点,能极大满足基层现场检测黄海希瓦氏菌的所有要求,无需专业人员即可定期进行检测,从而达到对病原菌感染养殖动物引起疾病起到良好的监测作用。本研究前期先行制备抗黄海希瓦氏菌单克隆抗体及多克隆抗体,为试纸条的研制准备材料,应用双抗夹心法建立了检测黄海希瓦氏菌的GICA方法,对胶体金标记单抗、抗体喷涂等各项指标进行优化,并确定了最佳条件,成功研制了黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条。本研究所研制的试纸条对黄海希瓦氏菌进行检测,5~10min肉眼即可判读结果,检测灵敏度达到105CFU/mL,最佳检测浓度为5×105~5×106CFU/mL。试纸条分别对两个浓度5×105、5×107CFU/mL的希瓦氏菌(KCCM41821)、迟钝爱德华菌(ATCC15947)、杀鲑气单胞菌(MT004)、河豚链球菌(KCTC3657)、哈维弧菌(ATCC14126)、灿烂弧菌(ATCC33125)、美人鱼弧菌(ATCC33539)、副溶血弧菌KCTC2471)、溶藻弧菌(KCCM40513)、创伤弧菌(ATCC2126)、鳗弧菌(KCTC2711)12株菌均无交叉反应。4℃或37℃存放6个月,检测结果稳定。该试纸条检测灵敏度高、特异性强,稳定性好,而且无需检测仪器即可检测黄海希瓦氏菌,特别适用于基层推广使用,可以对该菌引起的仿刺参疾病起到良好的监测作用。
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