研究背景 鼻咽癌 (Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是发生于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤，具有独特流行特征。最常见于中国南方(如广东、广西、湖南等省)及明显的家族聚居性。好发于青壮年，50多年来5年生存率仍在50％左右徘徊，严重危害广大患者身心健康。鼻咽癌发病机制的研究，是防治鼻咽癌的前提及基础。 已有研究发现人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)各等位基因与NPC有相关性。 Simons 等最早提出新加坡华人鼻咽癌与HLA-A2、-Bw46有关。Hildesheim等发现HLA-B*0207，1101 与鼻咽癌相关，同时发现中国人特有的一个单倍型 HLA-A*3303 -B*5801/2 -DRB1*0301 -DQB1*0201/2-DPB1*0401 与鼻咽癌有很高相关性。Goldsmith做了一项华南地区鼻咽癌患者的分析，发现正相关位点为HLA-A2，B14和B46，负相关位点有HLA-A11，B13和B22。 分子牛物学与遗产学研究发现，个体免疫反应强弱一方面可能是各等位基因呈递抗原能力的差别导致，另一方面可能是各等位基因调控区的差异导致的。因此，研究HLA基因调控区的多态性与疾病的相关性，可能为我们研究NPC的发病机制提供一个新的突破点。 研究目的 本研究选择DP为目的基因，主要采用PCR-SSP分型技术，对广东地区汉族人群鼻咽癌患者进行 HLA-Ⅱ类基因 DPB1-3’调控区序列多态性分析，探讨广东地区汉族人鼻咽癌和 DPB1-3’调控区的相关性，寻找易感基因类型，探讨调控区在病变过程中潜在的作用。此研究有望为了解鼻咽癌的病理机制、早期诊断和基因治疗方案提供线索。可能为我们研究鼻咽癌的发生机制提供一个崭新的途径。 材料与方法 1．研究对象：研究组为2004-2006年问在中山大学第二附属医院耳鼻喉科确诊为新发鼻咽癌病人及放疗后患者共104例，主要为广东藉。 对照组为中山大学第二附属医院耳鼻喉科病区非肿瘤病人105例。入组条件：EB 两项阴性；无肿瘤史或家族史；无乙型肝炎病史 (HbsAg 阴性)；STD三项阴性；无过敏性疾病。 2．实验材料 1)．试剂盒：E．Z．N．A血液基因组DNA提取试剂盒，购自美国 Omega公司；PCR 产物单管 Kit 纯化试剂盒购自广州市珀尔 (Pearl) 生物科技有限公司：AxyPrep Easy-96 质粒DNA试剂盒购自深圳市赛泰克生物科技有限公司。 2)．引物：调控区引物由赛百盛公司合成。 3)．其它试剂材料：LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶，购自大连宝牛物公司(TaKaRa公司)。核酸分子质量标准DL2000Marker购自广东东盛牛物公司。载体 pGEM-T easy购自 Prornega 公司，pMD18-T Vector 购白大连宝生物公司(TaKaRa 公司)。转染细胞DH5a感受态大肠杆菌，由中山大学生命科学院提供。 4)．测序使用美国应用生物系统公司3730基因分析仪。 3．实验方法 由中山大学生命科学院提供实验仪器、场地及技术支持。 1)．血液基因组DNA的提取：按照E．Z．N-A血液基因组DNA提取试剂盒(Omega公司)操作程序提取基因组DNA。 2)．设计特异性引物 2．1 PCR扩增：用非特异性 DPB1-UTR 引物扩增 DPB1-3’调控区基因片段，PCR 反应参数如下：95℃ 3 min，94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10 min。1％琼脂糖凝胶电泳，上样量2μL，Loading Buffer 染色，紫外灯下照相，确认PCR产物长度与所需调控区片段长度一致。 2．2 PCR产物的纯化：经单管PCR产物Kit纯化试剂盒操作程序进行纯化。 2．3 PCR产物的克隆：经纯化的PCR产物经连接、转化等步骤转染入感受态大肠杆菌质粒，挑克隆、提取质粒。 2．4 测序：对转入质粒的目的片段 (DPB1-3’调控区)进行序列测定。 2．5 分型及设计特异性引物：测定14个样本 DPB1-3’调控区分型，并设计相应的引物。 2．6 所有标本调控区分型。 4．统计分析 采用 SPSS 11.0 软件，分析疾病组与对照组调控区多态位点频率计算，确定与鼻咽癌相关的易感位点。 实验结果 1．调控区产物及有效克隆的确定：经引物扩增产牛的PCR产物显示为一条片段，大小约1200 bp。挑选经连接、转化后形成的单菌落，使用PcR法确认调控区片段插入质粒。 2．特异性引物的验证：已有的14个样本克隆结果，用特异性引物扩增，结果证实符合对特异性引物的要求。 3．DPB1-3’调控区等位基因分型：经Bioedit软件分析得出2种等位基因。 4．样本调控区分型结果：对两组基因型分布结果进行X<2>检验。鼻咽癌组BB基因型分布频率 (0.615) 明显高于对照组 (0.371)。B单倍体等位基因分布频率 (0.750)，明显高于对照组 (0.538)。 结论 鼻咽癌组 HLA-Ⅱ类基因DPB1位点3’调控区BB基因型分布频率(0.615)明显高于对照组 (0.371)。B单倍型分布频率(0.750)明显高于对照组(0.538)，RR=3.129，EF=0.34，差异具有统计学意义。表明DPB1位点3’调控区BB基因型、B单倍型等位基因与鼻咽癌的发生相关。