飞蝗翅特异表皮蛋白基因LmACP7的功能研究

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翅是昆虫重要的附属结构,在昆虫觅食、求偶、躲避敌害、迁飞等方面发挥着重要的作用。飞蝗是一种不完全变态发育的世界性作物害虫,因其具有功能强大的前后翅能够远距离、大规模迁移,导致大面积蝗灾的发生,致灾严重。因此,对飞蝗翅的生长、发育及变态的研究有利于掌握飞蝗生长发育规律,从而为蝗灾防治提供基础资料。  本文以飞蝗为研究对象,利用转录组数据库鉴定其所含表皮蛋白基因,并以翅表皮蛋白基因LmACP7为研究靶标,利用RNAi结合透射电镜技术探讨其在飞蝗翅发育过程中的生物学功能,得到如下结果:  1)利用课题组飞蝗转录组数据库鉴定出81个表皮蛋白基因,分为5个家族,其中含51个CPR家族表皮蛋白基因、2个Tweedle基因、9个含CPF/CPFL家族基因、9个CPAPs家族的表皮蛋白基因以及10个不属于上述任何家族的表皮蛋白基因。在 CPR家族表皮蛋白基因中发现3个含有几丁质结合域的翅表皮蛋白基因,其中LmACP7在四龄蜕皮前高表达。  2)以翅表皮蛋白基因 LmACP7为研究靶标,对该基因进行分析,发现其具有3个外显子和2个内含子,编码的蛋白含有一个RR-2基序,属于RR-2亚家族成员;同源性分析显示该蛋白与欧洲玉米螟cuticle protein7具有较高的同源性,可能在飞蝗翅发育过程中具有重要作用。五龄飞蝗不同组织RT-qPCR结果分析显示LmACP7在飞蝗翅组织中特异性高表达;不同发育时期RT-qPCR表达分析显示LmACP7在不同龄期若虫的翅芽中均有表达,而且均在龄期末期表达量最高,前期及中期表达较低,在成虫1、2天的表达也较低,具有时期特异性,是蜕皮前表皮蛋白基因,可能参与翅外表皮的形成。免疫组化结果发现LmACP7在若虫前期主要定位在细胞层,在蜕皮前转运到新形成的表皮层中(外表皮);利用胶体金免疫技术精细定位发现,LmACP7主要存在于成虫翅外表皮层中。同时,体外结合实验证实LmACP7能够与几丁质特异性结合。  3)利用飞蝗对 RNAi的敏感性,在四龄若虫期对该基因进行沉默后发现,飞蝗蜕皮后翅芽出现发育异常,HE染色发现细胞排列发生紊乱;在五龄若虫期对该基因进行沉默后发现,飞蝗蜕皮后成虫翅发育异常、皱缩畸形、蜕皮困难,最终死亡。对其翅进行超微结构观察发现,与对照组相比干扰掉该基因后翅细胞层,微绒毛以及细胞连接等被破坏,影响翅外表皮的形成,由于外表皮形成受阻导致内表皮结构也受到影响。同时,研究发现缺失LmACP7后引起翅表皮细胞排列发生紊乱、细胞连接被破坏,从而引发线粒体途径介导的细胞凋亡。  飞蝗是典型的渐变态昆虫,具有功能强大的前后翅,极具迁飞能力,其翅的结构特点与发育过程与家蚕、果蝇和赤拟谷盗等全变态模式昆虫不同。本文探讨了翅特异表皮蛋白基因LmACP7在飞蝗翅生长发育中的表达规律,并阐明了其在飞蝗翅形成中的作用,丰富了渐变态昆虫的研究内容,为以翅表皮蛋白基因对迁飞害虫(如粘虫、玉米螟等)防治的靶标提供重要的理论依据。
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