目的：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是一种重要的条件致病菌,是革兰阴性兼性厌氧非发酵菌。抗生素的广泛使用使细菌的耐药性越来越严重。PA的耐药主要分为天然耐药与获得性耐药。天然耐药由染色体介导,通常垂直传播给子代细菌,水平传播则很少或无。天然耐药性决定了一个菌种的野生表型。获得性耐药主要有三种机制：一是由于通透性降低或主动外排系统正调节导致到达靶位的抗菌药量减少；二是靶位修饰；三是产生p-内酰胺酶水解抗菌药物。基因的水平传播方式(horizontal gene transfer, HGT)是细菌之间互相交换或接受对方基因,接合(conjugation)是基因水平转移非常重要的途径。群体感应系统(quorum sensing, QS)是细菌重要的信号系统,其作用机制为信号分子进入细胞内与胞内受体结合然后启动相关基因的表达。多种细菌通过感知某种信号分子的浓度来检测周围细菌群体的数量变化,当信号分子达到某一阈值后,就会与一些转录调节子结合,调节相关基因的表达以适应环境变化。根癌土壤杆菌质粒Ti的接合过程需要酰基高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactones, HSL)参与,而HSL是QS系统重要的信号分子。课题组前期研究了HSL在铜绿假单胞菌接合反应中所起的作用,发现在HSL作用下,E. coli-PA接合反应频率增大,HSL通过调节多个接合相关基因的表达促进接合。与HSL相比,抗生素对于细菌而言也是一种信号分子。《Nature》的一篇综述回顾了上个世纪的抗生素研究,认为抗生素是一种良好的探测器,能够帮助人们了解微生物的复杂性。另一方面,人们对于抗生素对于细菌的作用靶点相对了解的比较明确,而HSL涉及到全局的调控系统,具体的机制比较复杂,很难阐明。抗生素也是细菌的次级代谢产物或由其演变而来,抗生素对细菌的作用不仅仅是杀菌或抑菌那么简单。研究发现,细菌的耐药与抗生素的使用密切相关。随着抗生素使用的增加,细菌对抗生素的抗性也随之增加。这种情况不仅限于PA和E. coli等革兰阴性杆菌,革兰阳性球菌亦如此,如在减少红霉素的使用以后,发现A类链球菌抗生素抗性株数量减少。SOS系统或者称为LexA调节子是微生物可诱导的DNA修复系统,lexA蛋白的调控网络系统帮助维持细菌DNA的完整性。已经证实亚抑菌浓度的抗生素可以激活SOS反应,有相关的文献报道抗生素对铜绿假单胞菌的作用与激活SOS反应相关。SOS反应跟细菌的接合的关系又是什么呢?细菌的接合这种生理行为涉及到细菌的很多调控系统,会不会与SOS的调控网络有很重要的相关性?我们有很多佐证,但是对于铜绿假单胞菌来说,详细的机制未明。本课题拟从铜绿假单胞菌临床常用的抗生素的亚抑菌浓度入手,先探索亚抑菌浓度的抗生素在铜绿假单胞菌的接合反应中所起到的作用。众所周知,抗生素具有抑制乃至杀灭细菌的作用,那怎么推测它具有促进耐药基因水平转移的作用呢?其实这并不矛盾,因为抗生素发挥作用的前提是要达到有效药物浓度及作用时间。通常抗生素对细菌的作用具有浓度和时间依赖性,所以为达到抑制甚至杀灭细菌的作用,临床应用抗生素时需根据药物代谢动力学参数定时定量给药,以维持抗生素浓度大于最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。然而,实际上有多种因素导致到达感染部位的抗生素仅达到“亚MIC"(sub-MIC)水平,其中不规范用药是一个重要原因；其次,细菌可形成了特殊结构,比如PA形成生物膜抵御抗生素；第三,人体器官的特殊结构,如血脑屏障可阻止某些药物进入脑室；第四,因药物在不同组织器官中的分布情况不同,以及受感染组织的血液供应欠佳等；第五,细菌虽然被人体吞噬细胞吞噬,但因机体免疫力较低而未被杀灭,反而吞噬细胞成为了细菌的庇护所。在亚MIC水平,抗生素杀灭不了细菌。本课题拟从临床常用抗生素的亚抑菌浓度入手,探索亚抑菌浓度的抗生素在铜绿假单胞菌接合反应中所起的作用及相应的分子机制。本课题拟从以下三方面展开研究：(1)首先优化课题组前期建立的供体菌E.coli与受体菌PA的接合模型,使之适合抗生素的处理研究；(2)观察比较抗生素对供体菌及受体菌的不同影响,然后研究亚MIC浓度抗生素对细菌接合反应的影响；(3)采用转录组测序技术(RNA-Seq)研究亚MIC抗生素作用下细菌的差异表达基因,筛选接合反应相关基因,进行相关通路的功能分析,并用荧光定量PCR验证转录组学的结果,从而全面阐明亚MIC抗生素对细菌接合反应的影响。方法：1.优化接合反应模型①供体菌与受体菌供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T),受体菌PAO1由美国罗切斯特大学Barbara H. Iglewski教授赠予。②滤膜杂交法与液体杂交法的比较滤膜杂交法与液体杂交法在接合前增菌、药物处理等步骤是相同的,不同点体现在供体菌与受体菌定量混合后,前者放在滤膜上杂交2h,后者放在液体环境下杂交2h,最后计算接合效率。③接合时间接合时间的选择需要考虑影响实验结果的因素与整个实验的周期,前期处理,后续洗膜涂板,抗生素筛选,接合子长出后数板计数的时间等,尝试了1h、2h、4h。④构建报告基因荧光检测法与数板菌落计数法的结果荧光检测法用的是双质粒抑制系统,接合前不发光,接合后抑制性质粒丢失从而接合子中的质粒发光。菌落数板计数法用抗生素平板筛选接合子,24h后数板计数接合子的数量。⑤接合相关的影响因素主要考虑滤膜上的接合菌量、洗膜时间和稀释倍数这3个因素,设计两水平三因素正交试验进行实验。2.抗生素的选择及处理方案根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)指南的推荐,筛选临床使用的肠杆菌科与铜绿假单胞菌的A、B级药物,然后根据市场提供的抗生素标准品的情况选用替卡西林、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、美罗培南和头孢毗肟这六种抗生素。因接合转移的主要元件在供体菌内,并经过试验的验证,实验中选择用抗生素处理供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T)。3.观察抗生素对供体菌的作用及其对接合反应的影响,摸索最适的亚MIC浓度与处理时间采用宏量肉汤稀释法与微量肉汤稀释法确定不同抗生素的亚抑菌浓度,绘制亚抑菌浓度抗生素处理的供体菌的生长曲线。因为抗生素处理的时间不同可分为两组：①在供体菌生长到对数期再用抗生素处理供体菌1h、2h；摇菌的总时间固定为10h；②从初始摇菌即用抗生素处理6h、8h、10h；观察接合效率的变化。4.转录组测序采用RNA-seq技术对不同亚抑菌浓度抗生素处理的供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T)的RNA进行测序和后续的功能性分析,包括亚抑菌浓度抗生素对接合的影响,对细菌的其它的调节作用及其可能产生的对宿主的影响。5. qPCR检测E. coli接合相关基因的表达采用不同亚抑菌浓度环丙沙星与左氧氟沙星处理供体菌6h、8h、10h,提取RNA逆转录为cDNA。采用荧光定量PCR检测接合相关基因traI、traG和参考基因araC的表达。结果：1.洗膜时菌体的稀释倍数是影响接合反应的主要因素,供、受体菌的接种量和洗膜时间是次要因素。接合实验的最佳条件为：洗膜时菌体的稀释倍数为240倍,滤膜上供、受体菌的接种量为30μL,洗膜时间为2min。接合反应的最适时间为2h。2.抗生素的处理：分别用替卡西林、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素、美罗培南、头孢吡肟来处理供体菌,我们以低于最低抑菌浓度的五个相对稳定的1、2递减的亚抑菌浓度1/2m、1/4m、1/8m、1/16m和1、32m为选择标准,留取了每个抗生素处理供体菌的五个亚抑菌浓度的样本做接合实验,经过计算,环丙沙星与左氧氟沙星这两种抗生素随着亚抑菌浓度的梯度变化,接合效率呈现出了规律性的变化。然而在供体菌生长到对数期时再用抗生素处理供体菌1h或2h,未能像抗生素处理10h那样呈现出规律性的变化。3.选择环丙沙星与左氧氟沙星处理供体菌,在抗生素处理6h、8h、10h时收取菌体做接合实验,观察接合效率,结果是：随着亚抑菌浓度的变化接合效率的差异在6h未体现出,而在8h时有着比较明显的差异：随着亚抑菌浓度的增高,接合效率也增高,对照组未加抗生素处理组接合效率最低。10h接合效率与8h的变化趋势一致。4.转录组测序的结果：采用生物信息学对转录组测序的结果进行分析,发现可将环丙沙星、左氧氟沙星作用下供体菌E. coli SM10λpir(pUCP24T)中RP4质粒相关基因的差异表达聚类为10类,部分基因表达模式一致,呈现随抗生素浓度下降而下降的趋势,重点关注了四型分泌系统(type Ⅳ secretion system, T4SS)相关的基因。5.采用不同亚抑菌浓度环丙沙星与左氧氟沙星处理供体菌6h、8h、10h,留取接合效率稳定的样本做荧光定量PCR,发现traI、traG这两个基因的表达变化较为明显。抗生素处理6h时,traI、traG的表达随着亚抑菌浓度呈上升趋势,抗生素处理8h时traI、 traG的表达明显升高,差异均有显著的统计学意义(P<0.01)结论：1.成功优化了接合模型。2.亚抑菌浓度的环丙沙星与左氧氟沙星可以促进大肠埃希菌与铜绿假单胞菌之间的接合反应效率。3.转录组测序的结果证明亚抑菌浓度的抗生素对接合反应有重要的影响,集中体现在RP4质粒接合相关过程。4.荧光定量PCR的结果证明亚抑菌浓度的抗生素能够上调接合相关基因traI和traG。