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目的:将蓖麻毒蛋白A链与抗表皮生长因子受体单克隆抗体偶联形成免疫毒素,并评价该偶联物的体外抗肿瘤效应。
方法:
1.RTA的提纯:采用研磨、磷酸缓冲液浸提、过滤、硫酸铵盐析及离心等步骤从蓖麻籽中获得蓖麻毒蛋白粗提液。再将此粗提液过sepharose4B柱,以D-半乳糖进行洗脱,将收集的蛋白峰样品过sephadex G-100柱,收集第二峰蛋白样品。此第二峰蛋白样品经β-巯基乙醇的还原作用后,先后经过DEAE-sephadex A-50阴离子交换层析、CM-sephadex C-50阳离子交换层析,合并第二、三峰蛋白样品进行SDS-PAGE检测。
2.免疫毒素的构建及鉴定:先将单克隆抗体EGFR mab与SPDP反应,再将反应混合液过sephadex G-25柱,除去过量的SPDP,收集蛋白峰样品单抗-PDP,以巯基乙醇法计算单抗与SPDP的结合比,接着将单抗-PDP与DTT反应,过sephadex G-25柱,除去过量的DTT,收集蛋白峰样品单抗.PDP-SH。将RTA与SPDP反应,再将反应混合液过sephadex G-25柱,除去过量的SPDP,收集蛋白峰样品RTA-PDP,以巯基乙醇法计算RTA与SPDP的结合比。将单抗-PDP-SH与RTA-PDP混合反应,反应液经sephadex G-150凝胶层析、Blue-sepharose CL-6B亲和层析,收集第二蛋白峰样品后,以巯基乙醇法计算单抗与RTA的偶联比。以SDS-PAGE检测免疫毒素的构建与纯度,以DAB显色法检测IT与HepG2肝癌细胞的结合能力,以间接ELISA方法测定IT的免疫反应性。
3.IT的体外抗肿瘤效应:以CCK-8法测定不同浓度的免疫毒素作用不同时间对HepG2细胞和L-O2细胞的体外抗肿瘤效应。
结果:
1.RTA的提纯:蓖麻毒蛋白粗提液经sepharose4B亲和层析、sephadex G-100凝胶层析,将获得的蛋白峰样品,进行SDS-PAGE,未以还原剂β-巯基乙醇处理,在约66kd处可见一电泳条带,以还原剂β-巯基乙醇处理后,在约32kd和34kd处可见两条电泳条带。提纯的蓖麻毒蛋白以β-巯基乙醇还原后,再经DEAE-sephadex A-50阴离子交换层析、CM-sephadex C-50阳离子交换层析,获得蛋白峰样品经SDS-PAGE,结果显示约在32kd处有一电泳条带。
2.免疫毒素的构建及鉴定:经巯基乙醇法计算得单抗-PDP和RTA-PDP中单抗、RTA与SPDP的结合比分别为1:2.58和1:2-34及免疫毒素中单抗与RTA的偶联比为1:1.16。将经sephadex G-150凝胶层析、Blue-sepharose CL-6B亲和层析获得的蛋白峰样品进行检测。SDS-PAGE结果显示,在样品缓冲液中未含有β-巯基乙醇,为一条分子量大于117kd的单一电泳条带,而在样品缓冲液中含有β-巯基乙醇,表现为三条电泳条带,分别位于约55kd处、约28kd处及约32kd处。DAB显色法结果显示,肝癌HepG2细胞免疫毒素组和阳性对照组均可见细胞膜棕色颗粒着色,空白对照组则未见细胞膜棕色颗粒着色。间接ELISA结果显示,免疫毒素与单抗的曲线走势一致,但各浓度下OD490值均较单抗组略低。
3.IT的体外抗肿瘤效应:CCK-8结果显示,免疫毒素在24h、48h及72h三个时间点及浓度梯度下均表现出对HepG2细胞和L-O2细胞不同的杀伤作用,24h和48h时间点下浓度O.5μg/ml时,HepG2细胞和L-O2细胞两组生长抑制率之间的差异有统计学意义标准(P<0.05),其余时间点及浓度梯度下差异有显著的统计学意义标准(P<0.01)。不同浓度的免疫毒素作用于生长良好的HepG2细胞24、48、72h,细胞生长受到明显抑制,且随免疫毒素的浓度增加和作用时间延长而增强。
结论:
1.蓖麻毒蛋白粗提液经sepharose4B亲和层析、sephadex G-100凝胶层析,可实现蓖麻毒蛋白的提纯。提纯的蓖麻毒蛋白以β-巯基乙醇还原后,再经DEAE-sephadex A-50阴离子交换层析、CM-sephadex C-50阳离子交换层析,可提纯RTA。
2.以SPDP为偶联剂,可成功构建免疫毒素。免疫毒素中的单克隆抗体与RTA偶联后,其与EGFR的结合位点没有被掩盖,仍能够较好地特异性与HepG2细胞表面的EGFR结合。对高表达EGFR的HepG2细胞仍然保持了免疫反应性。
3.免疫毒素对高表达EGFR的HepG2细胞具有选择性杀伤作用,且呈现明显的时间依赖性和浓度依赖性。