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目的:子宫内膜基质细胞(ESCs)的蜕膜化是子宫内膜容受性和胚胎着床成功的关键,在月经周期中收到雌孕激素的调控,并且这一过程伴随着间质到上皮的转化。特络细胞(TCs)是一种广泛存在与人体的各个组织与器官中,先前研究表明特络细胞(TCs)同样存在于女性生殖系统中,其胞膜表达丰富的雌孕激素受体,并参与子宫内膜基质细胞的成熟与分化,但是具体机制不清。本研究进一步探讨了 TCs来源的WNTs对ESCs蜕膜化和间充质向上皮转化(MET)的调节作用。为某些妇科疾病以及与蜕膜功能不全相关的生殖问题提供了一种新的细胞疗法。方法:取性成熟8周龄的SPF级的BALB/c的孕4天的雌性小鼠,提取原代子宫特络细胞和子宫内膜间质细胞。1.选取性成熟的8周龄的雌雄小鼠以2:1与前天晚8点合笼,早8点观察到有阴道栓记为孕第1天。2.腹腔注射过量的水合氯醛处死小,无菌超净台中取出子宫组织,纵向切开两侧宫角,用胶原酶消化切碎的子宫组织及用差时贴壁提取及提纯子宫内膜基质细胞和子宫特络细胞。3.采用免疫荧光的方法鉴定子宫内膜基质细胞,并基于ESCs的免疫荧光鉴定,对子宫内膜间质细胞进行纯度的测定,细胞角蛋白(Cytokeratin)染色为阴性,而波形蛋白染色(Vimentin)为阳性。在显微镜下随机选择三个不同的区域,并计数阳性细胞与总细胞的比率。4.采用双免疫荧光方法鉴定子宫特络细胞,波形蛋白染色(Vimentin)、CD34双阳性,并用倒置显微镜观察TCs的典型结构。5.通过QPCR Array分析WNTs配体在小鼠子宫ESCs和TCs中的差异表达。6.TCs原代细胞培养2天后传代培养24h后。加入不含血清的基础培养基,培养48h后收集上清,既为telocytes细胞的条件培养基(TCM)。7.用TCM培养ESC作为实验组,E2+P4+cAMP体外蜕膜化培养基为阳性对照组,空白培养基作为阴性对照组,建立实验条件模型。分别在作用3天和5天测定用WB和RT-PCR技术测定子宫内膜细胞蜕膜化和间质上皮转化的相关指标,同时观察相应的细胞形态的变化。8.运用shRNA沉默子宫内膜基质细胞CTNNB1基因(即表达β-catenin蛋白)。TCM培养沉默sh-catenin和scramble作用的ESC作为实验组,用TCM培养ESCs作为对照组。在培养3天收取细胞用WB和RT-PCR技术测定子宫内膜细胞蜕膜化和间质上皮转化的相关指标,同时观察相应的细胞形态的变化。结果:1.在荧光显微镜下ESCs显示波形蛋白(Vimentin)阳性/细胞角蛋白(Cytokeratin)阴性的免疫表型。免疫荧光法测定子宫内膜基质细胞纯度,在显微镜下随机选择3个不同区域,计算阳性细胞与总细胞的比例。结果表明:子宫内膜间质细胞纯度为(96.2±2.5)%。2.显微镜下小鼠子宫TCs具有典型结构:小的胞体,具有粗细的细长的胞质突起(Tps)。荧光显微镜下呈现vimentin、CD34双阳性。3.QPCR阵列检测Wnt配体和通路相关基因在TCs和ESCs中共85mRNA表达谱的相对表达(TCs/ESC),与ESCs相比,TCs含有相对高丰度的一系列Wnts配体和途径基因表达,包括高水平:FZD4、WIF1、SFRP4、SFRP1、FZD8、CCND1、WNT4、WNT2、TCF711、LRP5、SFRP2、NFATC1、DKK1、CTNNB1、CTNNBIP1、AES、RUVBL1、FZD1、KREMEN1、CCND2、DVL2、FOS11、FRZB、FZD9;低水平:WNT9A、WNT16、TCF7、WNT5A、FZD6、AXIN2、LEF1、MYC、NLK、WISP1、FOXN1、SOX174.实验组中ESC中的蜕膜化相关蛋白(cyclin-D3和desmin),MET相关上皮细胞标记物(E-cadherin)和β-catenin相关蛋白(β-catenin,foxo1)呈增加趋势。与MET相关的基质细胞标记物(N-cadherin)呈下降趋势。显微镜下观察细胞形态:在的空白对照中,ESCs表现为典型的基质细胞形状:细长纺锤体形状,没有明显的细胞间联系。在TCM处理组中,ESC逐渐转变为上皮细胞表型,表现为多核圆形细胞,具有分泌,半透明和丰富的细胞质。在E2+P4+cAMP体外蜕膜化阳性对照组中,ESC彼此紧密相连,从典型的基质细胞的纺锤形转变为圆形上皮细胞的典型形态。5.运用流式检测感染细胞分成2群细胞;WB、RT-PCR测定在ESCs沉默体系中β-catenin蛋白,结果显示β-catenin蛋白降低,验证构建shRNA体系成功。(P<0.05)6.当ESC沉默β-catenin体系会导致形态学的变化,呈圆形或椭圆形,阴性对照中的蜕膜细胞有上皮特征。同时,ESCs中通过shRNA1和shRNA2下调β-catenin导致蜕膜化标记物(cyclin-D3,Desmin),上皮细胞标记物(E-cadherin),以及下游转游蛋白(foxo1)的降低,以及基质细胞标记物(N-cadherin)的增加,(P<0.05)结论:这项研究提供了第一个证据,表明TCs可通过WNT/β-catenin信号通路增强ESCs的蜕膜化和MET。因此为某些妇科疾病以及与蜕膜功能不全相关的生殖问题提供了一种有希望的细胞疗法。