论文部分内容阅读
目的:肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,易早期发生转移,而且虽采用手术或介入等综合治疗后复发率仍较高,其原因与肝细胞癌易侵袭转移的生物学特性有关。研究表明,肝癌细胞的运动、侵袭和转移特性直接与肿瘤组织中HPA的高水平表达有关。明确HPA的表达与分泌机制和探索有效的治疗方法依然是临床研究的一大挑战。乙酰肝素酶（heparanase, HPA）是一种葡萄糖醛酸内切酶,在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中普遍高表达,也是目前发现的唯一可以降解硫酸乙酰肝素（heparan sulfate, HS）活性的酶,它通过切断硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）的HS侧链,而降解细胞外基质（extracellullar matrix, ECM）和血管基底膜（basement memberane, BM）释放活性物质,产生链式反应,加快血管生成,通过多种途径直接、间接促进肿瘤生长和侵袭转移。研究表明,肝癌细胞内存在Ca2+库依赖的Ca2+内流,是NO→cGMP敏感的（负性调控）Ca2+信号调控通路,而细胞内稳定的高Ca2+水平可明显增强肝癌细胞体外侵袭粘附的能力。本实验将细胞内Ca2+调控通路引入HPA的表达与分泌过程,探讨Ca2+在HPA的表达与分泌过程中发挥的作用,可为进一步探讨抑制肝癌侵袭和转移的治疗方法提供可靠的实验依据和理论基础。方法:肝癌细胞株SMMC-7721分对照组和试验组。对照组细胞常规培养,试验组细胞分别在培养体系中引入Ca2+及其激动剂毒胡萝卜内酯（TG）和TG抑制剂S-亚硝基-乙酰青霉胺（SNAP）干预,按时收获细胞。采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,测定细胞HPA mRNA含量,以?-actin作为内参照标准,对扩增产物通过凝胶扫描仪进行DNA电泳条带的密度值分析,将HPA与?-actin比值作为HPA表达水平的参数,对HPA产物进行相对定量;以Western blot方法检测SMMC- 7721细胞内以及培养上清中HPA蛋白表达的变化,并进行相对定量分析。数据采用SPSS12.0统计分析软件进行分析。结果:1 SMMC-7721肝癌细胞HPA mRNA在各实验组中的表达:在加入不同浓度CaCl2后,HPA mRNA表达的电泳条带亮度以及相对表达量无明显差异;在TG以及SNAP组电泳条带亮度以及相对表达量也无明显差异。可见,在mRNA水平对SMMC-7721肝癌细胞HPA的表达没有影响。2 SMMC-7721肝癌细胞培养体系中不同Ca2+浓度对HPA蛋白表达与分泌的影响:在加入0.2、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/ L浓度的CaCl2后,细胞内及培养上清HPA蛋白均有升高（P<0.05）,在0.2mmol/ L～1.0 mmol/ L CaCl2浓度之间呈一定的浓度依赖性,在1.0mmol/L CaCl2浓度梯度下,细胞内以及培养上清中HPA蛋白达稳定水平。肝癌细胞内Ca2+可有效的诱导肝癌细胞合成并分泌HPA蛋白。3细胞内Ca2+库的诱导释放对SMMC-7721肝癌细胞HPA蛋白表达与分泌的影响:本实验中4μmol/L TG处理SMMC-7721细胞,细胞内HPA蛋白表达量（2.596±0.187）显著高于对照组细胞内HPA蛋白表达（0.930±0.031） （P< 0.05）;同时培养上清中HPA蛋白表达量（1.403±0.023）显著高于对照组培养上清中HPA蛋白表达量（0.610±0.012） （P<0.05）,可见TG明显诱导SMMC-7721细胞HPA蛋白的表达与分泌。4 SMMC-7721肝癌细胞内Ca2+调控通路与HPA蛋白表达和分泌的关系:本实验中在TG4μmol/ L +SNAP200μmol/L组细胞内HPA蛋白表达量（0.951±0.056）显著低于TG组细胞内HPA蛋白表达量（2.596±0.187）（P<0.05）,但与对照组（0.930±0.031）和SNAP组（0.957±0.023）无显著性差异;同时培养上清中HPA蛋白表达量（0.594±0.018）显著低于TG组（1.403±0.023）（P<0.05）,但与对照组（0.610±0.012）和SNAP组（0.603±0.014）无显著性差异。可见,SNAP明显抑制了TG诱导的肝癌细胞HPA蛋白的表达与分泌,但对无TG处理的正常调控下的细胞则无明显的抑制作用。结论:1肝癌细胞内Ca2+在mRNA水平对HPA的表达没有影响,在蛋白水平可有效的诱导肝癌细胞合成并分泌HPA。2肝癌细胞内Ca2+库释放诱导剂毒胡萝卜内酯（TG）可明显诱导HPA蛋白的表达与分泌;而抑制剂S-亚硝基-乙酰青霉胺（SNAP）则抑制了TG的诱导作用。3肝癌细胞内Ca2+通过细胞内NO→cGMP调控的Ca2+信号通路在蛋白水平增强了HPA的表达和分泌,进而降解细胞外基质（ECM）和血管基底膜（BM）,诱导血管新生,促进肿瘤细胞的侵袭和转移过程。