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肝细胞肝癌(hepatocel lular carcinoma HCC,以下简称肝癌)在全球恶性肿瘤发病率中占第6位,恶性肿瘤死因中占第3位,中国的发病率更是高居世界之首。目前手术切除仍是肝癌最有效的治疗方法,但是因为较高的复发转移率严重影响了预后。因此,寻找有效防治肝癌转移的治疗方法具有重要的意义。溶瘤腺病毒能够特异的在肿瘤细胞内复制并裂解肿瘤细胞,还可携带外源性的治疗基因协同抑制肿瘤,在肿瘤的基因治疗方面具有良好应用前景。IL-24是一个新的抑癌基因,抗肿瘤谱广、抗肿瘤作用较强,但其对肝癌侵袭转移的作用及其机制并未闸明。第一部分构建安装甲胎蛋白启动子并表达IL-24基因的溶瘤腺病毒构建溶瘤腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24和Ad-AFP.E1A/GFP,研究其对不同的肝癌细胞的抑制作用。从质粒HS4-AFP-E1A-PolyA扩增得到目的基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体上,得到HS4-AFP-E1A-PolyA-T克隆载体,扩增IL-24基因,连接到pShuttle-Basic-EGFP载体上替换EGFP,得到pShuttle-Basic-IL-24.再从HS4-AFP-E1A-PolyA-T克隆载体上切下HS4-AFP-E1A-PolyA的片段,连接到pShuttle-Basic-IL-24载体上,得到pShuttle-Basic-IL-24-AFP-E1A,并将其转移到pAdxsi重组腺病毒骨架载体上,得到pAd-HS4-AFP-E1A-IL-24病毒质粒,经酶切鉴定构建正确。病毒质粒经扩增后包装、大量扩增、氯化铯梯度离心纯化,并用TCID50测定滴度。用构建的病毒Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24感染肝癌细胞SMMC-7721、Hep3B、MHCC97-H和正常肝细胞L02, CCK-8试剂盒检测Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24对不同细胞的杀伤作用。RT-PCR、Western Blot检测病毒感染MHCC97-H细胞后E1A和IL-24的表达。结果发现构建正确的重组腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24作用于不同细胞后,对高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H的杀伤能力最强,为52.63±9.42%(P<0.01),高于SMMC-7721和Hep3B细胞,对正常肝细胞L02基本没有影响。在感染Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24的MHCC97-H细胞中能检测到E1A和IL-24的表达。第二部分携带IL-24基因的溶瘤腺病毒对肝癌细胞的体外作用研究研究Ad.HS4.AFP.E1A/-24对高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H的抑制作用及其可能机制。用Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24感染高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H,检测细胞的增殖能力、细胞凋亡的情况以及体外侵袭、粘附和运动等功能的变化。用半定量RT-PCR、Western-blot和明胶酶谱法检测E-cadherin和MMP-2的表达水平。结果显示MHCC97-H细胞被Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24感染后,细胞增殖被抑制,细胞凋亡数量明显增加。体外功能试验显示细胞粘附、运动和侵袭能力被抑制(感染后细胞粘附数45.50±9.95个vs 88.83±18.91个,运动试验穿膜细胞数34.38±7.13个vs 57.17±10.78个,侵袭试验透膜细胞数24.07±6.91个vs 43.77±6.09个,均P<0.05)。mRNA和蛋白水平检测E-cadherin和MMP-2的表达,发现感染腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24的MHCC97-H细胞其E-cadherin表达显著增加(P<0.05),而MMP-2则显著下降(P<0.01)。第三部分携带IL-24基因的溶瘤腺病毒体内抑制肝癌肺转移的作用研究研究Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24靶向高转移潜能肝癌细胞MHCC97-H的干预作用并探讨其可能的分子机制。48只裸鼠肝内原位接种MHCC97-H细胞,随机平均分成6组,分别为Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24治疗组、Ad.HS4.AFP.E1A/GFP治疗组和对照组各两组,原位接种肿瘤后第4天,经尾静脉给药,治疗组用不同腺病毒108PFU/次,每3天给药一次,共计6次,对照组给予等量生理盐水注射。至6周末,不同治疗组各选取一组裸鼠处死,观察肝脏肿瘤的生长情况,肺组织HE染色观察转移情况,ELISA方法检测肿瘤组织上清液的IL-24浓度,免疫组化检测E-cadherin.VEGF和MMP-2的蛋白表达,剩余三组裸鼠观察生存时间。结果显示治疗组和对照组之间裸鼠体重和一般情况没有显著差异(P>0.05),三组间裸鼠的肝脏肿瘤的体积和重量没有显著差异(P>0.05)。Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24治疗组的裸鼠肺转移结节Ⅱ级为2.0±1.77个,Ⅲ级1.0±1.07个,Ⅳ级转移灶为0,均明显少于对照组(P<0.001)。Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24组裸鼠中位生存时间75天,Ad.AFP.E1A/GFP组72天,对照组为64天,治疗组的生存期长于对照组,但差异没有统计学意义(P>0.05)。Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24治疗组肿瘤上清的IL-24浓度为225.60±52.05 ng/ml,对照组为47.19±21.25 ng/ml,治疗组的IL-24表达水平远高于对照组,P<0.001。免疫组化结果显示Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24治疗组的肝癌组织E-cadherin的表达较对照组明显增强,而VEGF和MMP-2的蛋白表达明显低于对照组。结论1.构建了正确的溶瘤腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24,能表达病毒E1A基因和外源性的IL-24基因,对肝癌细胞MHCC97-H具有较强的抑制作用,而对正常肝细胞没有影响。2.腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24能抑制肝癌细胞MHCC97-H的增殖,促进其凋亡,并抑制其转移潜能。3.腺病毒Ad.HS4.AFP.E1A/IL-24对裸鼠肝癌的肺转移具有抑制作用,其作用机制可能和增强Ecadherin的表达,抑制MMP-2和VEGF的表达有关。潜在临床应用价值1.IL-24是一个抗肿瘤作用较强的抑癌基因,协同溶瘤作用,增强对肿瘤的抑制作用。2.溶瘤腺病毒的启动子由针对肝癌的甲胎蛋白启动子取代,靶向性较强,提高了临床应用的安全性。创新点本课题的研究内容既具有实用性,也有一定创新性。本课题的创新性主要体现在以下两点：1.采用了结构优化的甲胎蛋白启动子等调控基因的组合控制腺病毒载体的复制,使病毒针对肝癌的靶向性更强；同时结合治疗基因IL-24,协同腺病毒的溶瘤作用,有效的增强了抗肿瘤作用。2.IL-24基因是近年发现的抑癌基因,具有高效广谱的抗肿瘤作用,本课题发现它对肝癌肺转移具有较好的抑制作用,并初步探讨了该作用的分子机制。