流感(influenza)是一种传播于禽类和哺乳动物之间的呼吸道传染病,在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。流感病毒疫苗(influenza virus vaccine)是预防流感的主要措施。尽管已开发和上市多种流感疫苗,但有效控制流感发病及蔓延仍面临诸多挑战,目前的疫苗仅能保护与所选疫苗候选株相同或相近的流感毒株感染,难以产生针对多种毒株或新发毒株的广谱中和抗体(BRoadly neutralizing antibodies,bnAbs)。本研究第一部分利用生物信息学,查询2006-2009年PubMed所有流感病毒表面抗原血凝素(hemagglutinin,HA)的氨基酸序列,分析设计H1、H3和H5亚型的共有序列,分别命名为CON H1、CON H3和CON H5。该组序列以免疫原性极强HA的头部序列为主,也包含相对保守但免疫原性较弱的茎部序列。本研究基于这些共有序列分别构建了3种DNA疫苗,经双酶切和体外表达鉴定,分别命名为:pVKD1.0-CON H1、pVKD1.0-CON H3和pVKD1.0-CON H5,并用动物实验检测其免疫原性。本研究第二部分模拟不同流感病毒多次感染宿主的自然状态,除传统混合免疫外,设计3种疫苗的序贯免疫接种方案,探索研发活化抗流感病毒广谱中和抗体的新途径。将实验动物分为3组:序贯免疫组、混合免疫组和空载体组,检测其免疫原性、血凝抑制(hemagglutination inhibition,HAI)效价及诱导广谱中和抗体的能力,并从序贯免疫小鼠制备流感病毒广谱中和单克隆抗体,最后采用PR8病毒株行攻毒试验检测序贯免疫的保护作用。方法:一.流感病毒DNA疫苗的构建、鉴定及免疫原性检测应用back translation软件,将H1、H3和H5亚型流感病毒的表面抗原血凝素的共有序列密码子优化为哺乳动物密码子核酸序列,分别命名为CON H1、CON H3和CON H5。在它们前端加入酶切位点,尾端加入终止密码子和相应的酶切位点后进行序列合成。将人工合成的共有序列插入质粒pVKD1.0构建疫苗pVKD1.0-CON H1、pVKD1.0-CON H3和pVKD1.0-CON H5。用Sali和EcoRⅤ、EcoRⅤ和EcoRI及SalⅠ和BamHⅠ行双酶切鉴定。分别以lipofectamine2000TM法转染293t细胞,培养24小时后用免疫印迹法(westernblotting,WB)检测蛋白表达。用动物模型检测3种疫苗的免疫原性。将BALB/c小鼠分为四组:空载体组3只,疫苗免疫组各5只。分别在0、2和4周于右侧胫前肌注射空载体或相应的疫苗100μg,于第6周将小鼠麻醉后眼内眦取血,颈椎脱臼处死并分离提取脾细胞。分离的小鼠脾淋巴细胞以合成肽HA533(IYSTVASSL)和HA438(SYNAELLVAL)作为刺激原,用酶联免疫斑点法(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)检测每106个脾细胞中产生inf-γ的脾细胞数;用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测小鼠血清对灭活流感病毒株BR07H1、BR07H3和HK97H5的结合抗体滴度。以上实验组分别与空载体组进行比较并作t检验。二.疫苗序贯免疫的免疫原性、HAI效价和诱导广谱中和抗体的检测及攻毒试验将BALB/c小鼠分为三组,序贯免疫组、混合免疫组和空载对照组。序贯免疫组分别在0、4、8周于右侧胫前肌注射pVKD1.0-CON H1、pVKD1.0-CON H3和pVKD1.0-CON H5疫苗各100μg;混合免疫组则每次注射3种疫苗的混合液99μg(每种33μg),空载组每次注射空载体100μg。于第10周将小鼠麻醉后眼内眦取血后颈椎脱臼法处死并分离提取脾细胞。细胞免疫原性检测采用ELISPOT法,以合成肽HA533(IYSTVASSL)作为刺激原检测产生INF-γ的脾细胞数。体液免疫原性检测采用elisa法,分别检测小鼠血清对H1(BR07H1、TJ09H1和SH09H1)、H3(BR07H3)和H5(HK97H5和NV05H5)亚型灭活病毒株的ha抗体效价。HAI试验分别采用4株灭活的流感病毒株——2株H1亚型(TJ09H1、SH09H1)、1株H3亚型(SH09H3)和1株H5亚型(NV05H5),检测血凝抑制效价。中和试验采用H1(TE09H1、SI06H1、SI86H1和BR07H1)、H3(MO99H3、FJ02H3、WI05H3和BR07H3)和H5(VN04H5)亚型的假病毒株,检测小鼠血清中和抗体效价。为了检测抗体的中和活性是否由免疫球蛋白G(IGG)介导,各取2只实验组小鼠血清,检测剔除IGG前后的中和抗体滴度。为制备单克隆抗体,另选5只BALB/c小鼠同前行序贯免疫接种,末次接种后2周处死小鼠收集脾细胞,将其与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞系融合,通过中和试验逐个筛选3200个杂交瘤细胞系,经过2次确认,最终通过SC18H1假病毒株筛选分离出2种强效广谱中和性单克隆抗体。为确认序贯免疫的保护作用,选用PR8流感病毒株,通过鼻内滴注致死量病毒,分别感染经序贯免疫、混合免疫和空载组免疫后2周的小鼠,检测感染后14天之内各组小鼠体重变化和生存情况。结果:一.流感病毒DNA疫苗的构建、鉴定及免疫原性检测1.质粒双酶切鉴定酶切产物电泳后在5kb均可见与pVKD1.0载体片断相等条带,重组质粒电泳条带约为7kb,与预期的插入基因片段2kb大小相符。2.蛋白表达鉴定将重组DNA疫苗转染293T细胞后进行SDS-PAGE电泳和WB检测,结果显示约在90kd处可见预期蛋白条带。3.细胞免疫原性检测疫苗免疫后处死小鼠分离脾细胞,用肽HA533(IYSTVASSL)刺激后,pVKD-CON H1和pVKD-CON H5组IFN-γ斑点形成细胞(spotformingcells,SFCS)数与空载组差异有显著性(p<0.01),pVKD-CON H3组IFN-γSFCs数与空载组无显著性差异。用肽ha438(synaellval)刺激后,,pVKD-CON H3组与空载组IFN-γSFCs数差异具有显著性(p<0.05),,pVKD-CON H1和,pVKD-CON H5组与空载组无显著差异。4.体液免疫原性检测免疫后小鼠血清中针对BR07H1的抗体结果显示,pVKD1.0-CON H1和pVKD1.0-CON H5组与空载组间血清抗体滴度差异具统计学意义(p<0.01),pVKD1.0-CON H3组与空载组间差异无统计学意义。针对BR07H3的抗体结果显示,pVKD1.0-CON H3组与空载组间抗体滴度差异具显著统计学意义(p<0.01),其余实验组与空载组间抗体滴度差异无统计学意义。针对HK97H5的抗体结果显示,pVKD1.0-CON H5组与空载组间抗体滴度差异具显著统计学意义(p<0.01),其余实验组与空载组间抗体滴度差异无统计学意义。二.疫苗序贯免疫的免疫原性、血凝抑制能力、诱导广谱中和抗体的检测及攻毒试验1.细胞免疫原性检测基于IFN-γ和优势表位肽HA533(iystvassl)的ELISPOT法结果:每106个脾细胞的SFCs,空载组、序贯免疫组和混合免疫组分别为11±5、948±54和985±192。序贯免疫组和混合免疫组与空载组均有显著差异(p<0.01);序贯免疫组和混合免疫组间差异无统计学意义。2.体液免疫原性检测(1)H1亚型的检测结果:针对与CON H1同源性相对较高的SH09H1,序贯免疫组和混合免疫组的抗体滴度均高于空载体对照组(p<0.01),混合组高于序贯组(p<0.01)。针对TJ09H1,序贯免疫组的和混合免疫组诱导的抗体滴度和空载体组对比均无差异(p>0.05)。针对与CON H1同源性相对较低的BR07H1,序贯免疫组和混合免疫组的抗体滴度均高于空载体组(p<0.01),且序贯免疫组高于混合免疫组(p<0.05)。(2)H3亚型的检测结果:针对BR07H3,序贯免疫组和混合免疫组的抗体滴度与空载组比较均有统计学意义(p<0.01)。(3)H5亚型的检测结果:针对HK97H5和NV05H5,序贯免疫组和混合免疫组的抗体滴度和空载体组比较均有差异(p<0.05,p<0.01),混合组均高于序贯组(p<0.01)。3.HAI抗体反应效价的测定采用的4个灭活病毒株,除TJ09H1,针对其他3个流感病毒株均诱导出较强的HAI反应。针对SH09H1,实验组诱导抗体滴度均高于空载组(p<0.01),混合组优于序贯组(p<0.01)。针对SH09H3实验组的血凝抑制效价均显著高于空载组(p<0.01),实验组之间均无差异。针对NV05H5实验组血凝抑制效价均显著高于空载组((p<0.05),(p<0.01)),实验组之间均无差异。4.序贯免疫诱导广谱中和抗体反应的检测及抗体型别鉴定用于中和实验的假病毒株基于以往建立的假病毒平台,包括H1、H3、H5以及部分其它型别。(1)针对H1亚型的bnAbs反应检测:针对与CON H1同源性相对较高的TE09H1,实验组和空载组之间均有显著差异(p<0.01),序贯免疫组的nAbs稍低于混合免疫组,两者之间无统计学差异。针对其他3种与CON H1同源性相对较低的H1亚型毒株,混合免疫组几乎不产生中和抗体免疫,而序贯免疫组仍可产生一定量的中和抗体,和空载体组的差异均具统计学意义(p<0.01),序贯组显著优于混合组。(2)针对H3亚型的nAbs反应检测:BR07H3和CON H3同源性最高,与空载组比较实验组均产生显著的nAbs反应(p<0.01),实验组之间无差异。MO99H3、FJ02H3和WI05H3同源性相对较低,序贯组产生的抗体滴度均高于混合组,其中针对同源性最低的MO99H3,实验组之间的差异具统计学意义(p<0.05),而针对WI05H3,实验组之间有显著差异(p<0.01)。(3)针对H5亚型的nAbs反应检测:采用的病毒株VN04H5和NV05H5与CON H5的同源性均较高,实验组均产生了较高的nAbs滴度,混合组高于序贯组,差异均具统计学意义(p<0.01)。(4)中和抗体型别鉴定:对比血清样本在用蛋白G琼脂糖珠剔除IGG前后的nAbs滴度,结果显示IGG剔除后血清样本对所有病毒株均无中和活性,包括之前显示中和活性较强的TE09H1,BR07H3和VN04H5,这一结果确认流感病毒疫苗的中和活性主要由IGG介导。5.广谱单克隆抗体分离最终通过sC18H1假病毒株筛选分离出2种强效广谱中和性单克隆抗体:5A3-f1、5A3-f2,具有针对试验中所有H1和H5亚型以及部分H3亚型病毒的广谱中和活性,半数抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50)达到了微克级,尤其是针对SC18H1和TE09H1的IC50分别低至96.9ng/ml和11.1ng/ml。中和H5亚型病毒的活性也可达微克级。另外,针对FJ02H3,5A3-F1的IC50值为1.0μg/ml,5A3-F2的IC50值为0.5μg/ml。5A3-F2甚至具有抗H8亚型病毒的较弱的中和活性。而对于其他亚型,5A3-F1和5A3-F2均无中和活性。6.攻毒试验结果用和2009H1N1大流行病毒株TE09H1之间有交叉反应的PR8病毒株,致死量感染后,空载组小鼠在第14天仅1只小鼠存活,所有小鼠体重均大幅下降;而混合组小鼠全部得到保护,优于序贯组(序贯组有一只小鼠死亡),大多数疫苗免疫后小鼠体重都有所恢复。结论:本课题利用流感病毒H1、H3和H5亚型的共有序列构建的流感病毒DNA疫苗和动物模型,模拟人类感染流感病毒的自然过程。应用流感病毒DNA疫苗序贯免疫接种策略,依据全亚型流感毒株的中和抗体评价指标,探索诱导活化更广谱高效中和抗体的新途径。得出以下结论:1.利用流感病毒H1、H3及H5亚型流感病毒的HA抗原共有序列构建的DNA疫苗具有较强的免疫原性。2.序贯免疫法较传统的混合免疫法针对H1、H3和H5亚型流感病毒产生的nAbs更广谱,交叉中和活性更高。3.利用序贯免疫法可以相对便利地获得广谱高效的单克隆抗体。4.攻毒试验确认了序贯免疫策略的保护作用,有望成为防治流感的新方法。