目的联合网络药理学与转录组学技术,探讨复方丹参滴丸对自发性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠认知功能障碍的影响。方法本课题选取6周龄雄性自发性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠32只,随机分为模型组(DM组)、复方丹参滴丸低剂量组(CL组,13.5 mg/kg/d)、复方丹参滴丸中剂量组(CM组,27 mg/kg/d)及复方丹参滴丸高剂量组(CH组,40.5 mg/kg/d),同周龄雄性C57BL/6J小鼠8只作为正常对照组(NC组)。适应性喂养1周后,NC组予以普通饲料喂养,其余组均以高糖高脂饲料喂养。4周后小鼠尾静脉取血测随机血糖,连续2次随机血糖>13.9 mmol/L,则认为2型糖尿病小鼠模型造模成功。每天各给药组分别给予不同浓度的复方丹参滴丸浸膏灌胃,DM组和NC组均给予等量生理盐水灌胃。干预12周后,采用Morris水迷宫空间探索试验,测试小鼠的空间学习记忆能力,利用小鼠核磁共振成像观察小鼠海马体积变化。处死小鼠后,立即分离留取小鼠海马组织标本,一部分进行HE染色、尼氏染色等,用于海马组织形态学观察,另一部分应用转录组学对小鼠海马组织进行高通量测序,筛选出差异基因,并进行生物信息学分析。同时,应用网络药理学探索复方丹参滴丸对糖尿病认知功能障碍的影响,在TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 和 DisGeNET 等 6 个数据库中分别检索糖尿病认知功能障碍相关基因;采用TSMSP数据库检索复方丹参滴丸所含的3味中药(丹参、三七和冰片),在TCMSP数据库中检索各个有效成分的靶基因,利用Cytoscape3.7.1软件及其插件对靶基因进行分析,并结合基因本体论分析及KEGG通路注释分析,完成“成分-靶点-通路-疾病”可视化网络创建。最后将转录组学与网络药理学预测结果相结合,并用小鼠海马组织进行初步验证。结果1.各周龄KK-Ay小鼠的体重、随机血糖均高于NC组(P<0.001);和DM组相比,各给药组的体重下降(P<0.05),血糖呈下降趋势但无统计学差异(P>0.05)。2.Morris水迷宫实验结果表明,与NC组相比,DM组小鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.01),穿越平台次数明显减少(P<0.001);与DM组小鼠相比,CL、CM和CH组逃避潜伏期缩短(P<0.05),穿越平台次数增加(P<0.05)。3.小鼠核磁共振成像扫描结果显示,与NC组相比,KK-Ay小鼠海马可见低信号区,且DM组小鼠海马体积显著减小(P<0.001);与DM组相比,CM、CH组小鼠海马体积增加(P<0.05)。4.与NC组相比,DM组血清TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平增高(P<0.01);与DM组相比,各给药组炎症因子表达水平均有一定的下降(P<0.05)。5.通过观察小鼠海马组织的HE染色、尼氏染色和透射电镜图像,DM组小鼠海马CA1区神经元细胞排列松散,层次紊乱,可见大量形态异常细胞,尼氏小体减少。神经元细胞核膜皱缩,核仁深染边集,线粒体肥大肿胀,可见空泡变性。而各给药组小鼠海马组织神经元病理状态与DM组相比均有不同程度的减轻。6.通过TCMSP数据库检索得到复方丹参滴丸各个有效成分的作用靶点121个。通过检索 TTD、DrugB ank、OMIM、GAD、PharmGKB 和 DisGeNET 等6个疾病基因相关数据库,得到219个糖尿病认知功能障碍疾病靶点。据此构建了复方丹参滴丸改善糖尿病认知功能障碍潜在靶标的蛋白质-蛋白质互作网络,并进行GO分析、KEGG分析,主要涉及神经营养因子信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路等。利用NIMNT数据库中的疾病分析功能,富集复方丹参滴丸可能的适应症一一冠状动脉疾病、动脉硬化性心血管疾病、阿尔茨海默病、2型糖尿病等。7.通过高通量测序技术分析了 NC组、DM组和CM组小鼠海马的mRNA表达谱;通过GO富集分析及KEGG通路注释,131条由网络药理学预测的信号通路与136条经高通量测序预测的信号通路相交集的通路有7条。查阅相关文献,选取其中与糖尿病认知功能障碍关联性较高的Toll样受体通路进行初步验证。与NC组相比,DM组TLR-4、MyD88及NF-κB p65的mRNA及蛋白表达水平均增高(P<0.05),而与DM组相比,各给药组的上述基因表达水平均有不同程度降低(P<0.05)。结论复方丹参滴丸可改善KK-Ay小鼠糖尿病认知功能障碍,其作用机制可能与抑制TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路有关。