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目的本课题组前期成功利用卵巢癌SKOV3细胞株建立了卵巢癌的裸鼠顺铂耐药模型, 得到了卵巢癌顺铂获得性耐药细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ,并对其耐药过程进行了动态系统生物学分析,整和基因表达谱及蛋白质谱的数据信息后,筛选到α2巨球蛋白(A2M)和视黄酸结合蛋白Ⅱ (CRABP2)在各处理组的耐药细胞中均显著降低。本实验继续前期的研究,将A2M和CRABP2导入TCGA提供的499例卵巢癌人类组织全基因组表达谱数据中,分别分析它们与卵巢癌患者铂类化疗耐药和临床预后等的相关性,为将A2M和CRABP2作为潜在的卵巢癌铂类耐药途径的上游调控分子提供临床依据。另外,进一步在基因和蛋白水平上对A2M和CRABP2进行功能验证,并探讨它们表达失衡后对下游耐药相关信号通路的影响,为寻找逆转卵巢癌顺铂耐药的新的靶点奠定基础。方法利用TCGA数据库分析A2M和CRABP2基因的mRNA表达在敏感和耐药患者中的差异；ROC曲线分析二者的表达是否与耐药相关；采用Pearson相关分析二者的表达与卵巢癌患者的总生存期,化疗间隔生存期和无进展生存期的关系；Cox regression分析A2M和CRABP2基因诊断卵巢癌患者耐药的敏感性；最后将TCGA提供的283例卵巢癌患者全基组表达谱数据分别分为A2M和CRABP2高低表达两个组,Kaplan-Meierw分别分析卵巢癌患者铂类化疗间隔生存期在A2M和CRABP2高低表达组之间的差异。利用课题组前期建立的卵巢癌顺铂获得性耐药的SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞株和顺铂敏感的SKOV3-GFP亲本细胞株分别在裸鼠皮下种植成瘤,成瘤后分次顺铂体内干预,实时荧光定量PCR和Western Blot验证分次顺铂干预的移植瘤组织中A2M和CRABP2的mRNA和蛋白表达,检测瘤组织中与细胞增殖及凋亡相关的主要通路中重要节点基因的表达水平,分析二者的表达变化对下游信号通路表达变化的影响。利用PWPI和pSico慢病毒表达系统和SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞株,构建CRABP2基因过表达的顺铂耐药细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2,并且采用mcherry红色荧光标记,CCK试剂盒分析过表达CRABP2后细胞的IC50、耐药指数的变化,Western Blot检测CRABP2基因过表达后对细胞周期调控相关蛋白表达和下游Fas细胞凋亡信号通路上节点基因的蛋白表达的影响。结果相对于敏感病例,A2M和CRABP2基因在铂类耐药患者表达下降(P<0.05,P<0.05),与耐药相关(P<0.05,P<0.05),与卵巢癌患者总生存期,化疗间隔生存期和无进展生存期高度相关(P<0.00,P<0.00),它们的表达量越高,患者的生存期越长；Cox regression分析结果也表明二者可以作为独立的卵巢癌患者预后的指标。ROC曲线分析发现A2M和CRABP2的表达与卵巢癌患者的铂类耐药相关(Area=0.969,0.980) 。Kaplan-Meierw分析结果证实A2M和CRABP2高低表达组的患者的铂类化疗间隔生存时间均有显著差异(P<0.00)。细胞凋亡相关的Fas信号通路上重要节点基因Fas, FADD, Caspase10, Caspase9和Caspase3随顺铂注射次数的增加在耐药组织中相对低表达(P<0.00),而其下游与DNA修复相关的基因PARP1随顺铂注射次数的增加在耐药的移植瘤组织中相对高表达(P<0.05)。所有这些基因在移植瘤组织中的蛋白表达也呈现与mRNA大致一致的趋势。不同次数顺铂作用后的瘤组织中A2M、CRABP2的mRNA相对表达量与Fas信号通路节点基因和下游PARP1的表达变化均存在相关性(P<0.05,P<0.00)。相对于SKOV3-GFP/DDPⅡ和空白对照的SKOV3-GFP/DDPⅡ-Blank细胞株,过表达CRABP2的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2细胞株对于顺铂的IC50均显著降低(P<0.00),耐药指数明显下降(P<0.00)；其细胞周期被显著抑制,细胞凋亡被激活：细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4、CDK6和CDK2以及细胞周期蛋白cyclin D1的表达在SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2细胞中显著减弱(P<0.00),而细胞周期的阻断剂p27 kip1的蛋白表达显著增强(P<0.00);Fas凋亡信号通路上的节点基因Fas、FADD、Caspase10、 Caspase9和Caspase3的蛋白表达显著增强(P<0.00),而凋亡信号通路下游的DNA修复相关基因PARP1的蛋白表达则显著降低(P<0.05),即过表达CRABP2基因后的卵巢癌顺铂耐药细胞恢复了对顺铂的敏感性。结论A2M和CRABP2与卵巢癌的顺铂耐药有关,它们在耐药的卵巢癌细胞和组织中表达减弱。二者作为潜在铂类耐药调控信号途径的上游关键信号分子,可通过激活Fas凋亡信号通路的作用维持卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性,过表达后可使耐药的卵巢癌细胞恢复对顺铂的反应性。这给临床上逆转卵巢癌铂类耐药的治疗提供了新的靶点和理论基础。