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[研究背景]
在HIV流行时代,隐球菌的全球传播造成隐球菌病负荷急剧增加。2014年全球隐球菌脑膜炎病例统计达223,100例，死亡约181,100人/年。该菌在我国同样造成较大的疾病负担。1985-2010年中国大陆共报道8769例隐球菌脑膜炎病例。该菌在中国具有独特的流行方式，主要感染非艾滋病人群，个别导致比艾滋病患者更严重的表现和不良预后。因此，开展隐球菌流行病学和病原学研究有助于明确国内独特的病原学分布和疾病模式。近20年来各省份相继开展了当地的隐球菌流行病学研究。广东省作为国内重要病源区，有必要开展本地区多中心的隐球菌病原学和流行病学研究，以明确当地的病原菌分布和致病模式。
1、广东省隐球菌临床株病原学特征研究
[研究目的]
明确广东省临床分离株的病原学特征，包括毒性因子、体外药敏。
[研究方法]
对广东省来源的84株临床分离株进行单菌落转菌纯化、质谱鉴定（MALDI-TOFMS）；37℃培养观察高温生长耐受性；利用黑色素培养基、尿素培养基分别检测黑色素、尿素酶产生能力；采用CLSI方案进行体外抗真菌药物敏感试验。
[研究结果]
（1）从2010.1至2019.3收集来自广东省6家三甲医院的临床标本分离株共84株，以男性（n=63，75.0%）、中青年（n=73，86.9%）、内科（n=79，94.0%）、肺部和脑部感染（n=69，82.1%）来源为主。
（2）毒性因子检测中，所有菌株均可在37℃环境生长良好；发现1株黑色素试验阴性、2株尿素酶试验阴性菌株。
（3）体外药敏实验中，除Z6、J12号生长不良外，余82株临床株中有3株非野生型（NonWildType，NWT），79株为敏感野生型（WildType，WT），其中伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑、两性霉素B各有1株非野生型。从MIC分布上看，氟康唑（StD:1.40）、氟胞嘧啶（StD:2.13）的MIC值离散程度大，最大值是最小值64倍，而泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑的MIC值分布相对集中且维持在较低范围。
（4）除了两性霉素B外，2株表型变异株对其他药物的MIC值明显偏低。
（5）本研究药敏和实际疗效关系存在矛盾结果。同一患者不同时间分离的G3、G4株和同一患者不同部位分离出的J6、J11株均保持类似的体外敏感性，但临床疗效欠佳，而G25株的药敏和疗效具有较高的一致性。
[研究结论]
（1）广东省隐球菌临床株存在表型变异株，可能与环境抗逆性相关，与侵袭性关系不明。
（2）体外药敏对常用药基本保持敏感，同时也出现可能耐药的非野生株。
（3）体外药敏监测和实际疗效的直接关系需综合判断，推荐个体化监测并结合临床分析。
2、广东省隐球菌临床株分子分型鉴定及遗传进化分析
[研究目的]
明确广东省隐球菌临床分离株的分子分型及遗传进化关系。
[研究方法]
分别提取84株临床分离株基因组DNA，通过PCR扩增真菌ITS及SOD1片段，产物送测序，确定隐球菌变种、基因型；通过扩增交配型基因片段，产物跑胶比对标准株确认隐球菌交配型；按MLST方案对7个管家基因（CAP59、GPD1、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1和URA5）进行PCR扩增、测序，检索MLST数据库获得ST分型；利用BioEdit对7个管家基因进行串联，采用MEGA7.0软件对串联序列构建系统发育树并进行系统进化分析。
[研究结果]
（1）广东省临床株分子分型高度同质：以新生格鲁比变种（n=80，95.2%）、VNI基因型（n=79，94.0%）、α配型（n=84，100%）、ST5（n=75，89.3%）型为主。
（2）本地区分子分型构成较丰富：包括格鲁比变种（n=80，95.2%）的VNI、新生变种的VNIV（n=1，1.2%）、格特变种（n=4，4.8%）的VGI、VGII基因型均有发现。基因型上绝大部分为VNI（n=79，94.0%），VNIV/VGI/VGII各发现1/3/1株。
（3）MLST分型也呈现多样性，除了最常见的ST5（n=75，89.3%）、ST31（n=2，2.4%）外，国内其他地区报道过的ST4、ST106、ST57在本地区均有发现。另外，本地区首次发现ST7（n=1）、ST278（n=1）。
（4）本次研究未发现VNⅡ/Ⅲ基因型、VGⅢ/Ⅳ基因型和MATa交配型。
（5）深圳来源的ST7株在系统发育上与北美弱致病的VGⅡb亚型聚类，且体外药敏对5-氟胞嘧啶（MIC=8mg/L）和氟康唑（MIC=16mg/L）的MIC升高，临床上采用5-氟胞嘧啶+氟康唑治疗疗效不佳，且患者颅脑影像学出现进展，这与弱致病的温哥华同源株R273存在不同。
[研究结论]
（1）广东省隐球菌临床株分子分型高度同质，以格鲁比变种、VNⅠ基因型、α配型、ST5型为主，但分型构成丰富，包括ST4、ST5、ST7、ST31、ST57、ST106、ST278这7种ST型均有发现。
（2）本地区发现的VGⅡb型存在不同于原发地的表型和毒力，值得关注和深入研究。
在HIV流行时代,隐球菌的全球传播造成隐球菌病负荷急剧增加。2014年全球隐球菌脑膜炎病例统计达223,100例，死亡约181,100人/年。该菌在我国同样造成较大的疾病负担。1985-2010年中国大陆共报道8769例隐球菌脑膜炎病例。该菌在中国具有独特的流行方式，主要感染非艾滋病人群，个别导致比艾滋病患者更严重的表现和不良预后。因此，开展隐球菌流行病学和病原学研究有助于明确国内独特的病原学分布和疾病模式。近20年来各省份相继开展了当地的隐球菌流行病学研究。广东省作为国内重要病源区，有必要开展本地区多中心的隐球菌病原学和流行病学研究，以明确当地的病原菌分布和致病模式。
1、广东省隐球菌临床株病原学特征研究
[研究目的]
明确广东省临床分离株的病原学特征，包括毒性因子、体外药敏。
[研究方法]
对广东省来源的84株临床分离株进行单菌落转菌纯化、质谱鉴定（MALDI-TOFMS）；37℃培养观察高温生长耐受性；利用黑色素培养基、尿素培养基分别检测黑色素、尿素酶产生能力；采用CLSI方案进行体外抗真菌药物敏感试验。
[研究结果]
（1）从2010.1至2019.3收集来自广东省6家三甲医院的临床标本分离株共84株，以男性（n=63，75.0%）、中青年（n=73，86.9%）、内科（n=79，94.0%）、肺部和脑部感染（n=69，82.1%）来源为主。
（2）毒性因子检测中，所有菌株均可在37℃环境生长良好；发现1株黑色素试验阴性、2株尿素酶试验阴性菌株。
（3）体外药敏实验中，除Z6、J12号生长不良外，余82株临床株中有3株非野生型（NonWildType，NWT），79株为敏感野生型（WildType，WT），其中伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑、两性霉素B各有1株非野生型。从MIC分布上看，氟康唑（StD:1.40）、氟胞嘧啶（StD:2.13）的MIC值离散程度大，最大值是最小值64倍，而泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑的MIC值分布相对集中且维持在较低范围。
（4）除了两性霉素B外，2株表型变异株对其他药物的MIC值明显偏低。
（5）本研究药敏和实际疗效关系存在矛盾结果。同一患者不同时间分离的G3、G4株和同一患者不同部位分离出的J6、J11株均保持类似的体外敏感性，但临床疗效欠佳，而G25株的药敏和疗效具有较高的一致性。
[研究结论]
（1）广东省隐球菌临床株存在表型变异株，可能与环境抗逆性相关，与侵袭性关系不明。
（2）体外药敏对常用药基本保持敏感，同时也出现可能耐药的非野生株。
（3）体外药敏监测和实际疗效的直接关系需综合判断，推荐个体化监测并结合临床分析。
2、广东省隐球菌临床株分子分型鉴定及遗传进化分析
[研究目的]
明确广东省隐球菌临床分离株的分子分型及遗传进化关系。
[研究方法]
分别提取84株临床分离株基因组DNA，通过PCR扩增真菌ITS及SOD1片段，产物送测序，确定隐球菌变种、基因型；通过扩增交配型基因片段，产物跑胶比对标准株确认隐球菌交配型；按MLST方案对7个管家基因（CAP59、GPD1、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1和URA5）进行PCR扩增、测序，检索MLST数据库获得ST分型；利用BioEdit对7个管家基因进行串联，采用MEGA7.0软件对串联序列构建系统发育树并进行系统进化分析。
[研究结果]
（1）广东省临床株分子分型高度同质：以新生格鲁比变种（n=80，95.2%）、VNI基因型（n=79，94.0%）、α配型（n=84，100%）、ST5（n=75，89.3%）型为主。
（2）本地区分子分型构成较丰富：包括格鲁比变种（n=80，95.2%）的VNI、新生变种的VNIV（n=1，1.2%）、格特变种（n=4，4.8%）的VGI、VGII基因型均有发现。基因型上绝大部分为VNI（n=79，94.0%），VNIV/VGI/VGII各发现1/3/1株。
（3）MLST分型也呈现多样性，除了最常见的ST5（n=75，89.3%）、ST31（n=2，2.4%）外，国内其他地区报道过的ST4、ST106、ST57在本地区均有发现。另外，本地区首次发现ST7（n=1）、ST278（n=1）。
（4）本次研究未发现VNⅡ/Ⅲ基因型、VGⅢ/Ⅳ基因型和MATa交配型。
（5）深圳来源的ST7株在系统发育上与北美弱致病的VGⅡb亚型聚类，且体外药敏对5-氟胞嘧啶（MIC=8mg/L）和氟康唑（MIC=16mg/L）的MIC升高，临床上采用5-氟胞嘧啶+氟康唑治疗疗效不佳，且患者颅脑影像学出现进展，这与弱致病的温哥华同源株R273存在不同。
[研究结论]
（1）广东省隐球菌临床株分子分型高度同质，以格鲁比变种、VNⅠ基因型、α配型、ST5型为主，但分型构成丰富，包括ST4、ST5、ST7、ST31、ST57、ST106、ST278这7种ST型均有发现。
（2）本地区发现的VGⅡb型存在不同于原发地的表型和毒力，值得关注和深入研究。