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支气管哮喘是一种呼吸系统的常见病,全球发病率、死亡率逐年增高。慢性气道炎症、气道高反应(AHR)及气道重建是哮喘主要特征。其中,气道重建导致气流不可逆的阻塞及持续气道高反应,是哮喘治疗变得困难的因素之一。因此,深入探讨气道重建的机制对发现新的、有效的哮喘治疗方法具有重要意义。近几年的研究发现,氧化应激、吸烟、过敏原、生长因子、细胞因子和炎症介质等多种因素参与了气道重建,而EGFR活化发挥中心调节作用。EGFR及其配体在气道重建中的作用复杂,进一步研究调节EGFR和配体活性机制,成为当今研究热点。本课题建立小鼠慢性哮喘模型,观察气道结构改变、肺组织EGFR表达变化、BALF中EGFR配体TGF-α浓度变化及地塞米松的干预;体外实验,进一步观察EGFR活化在TGF-α、IL-13、TNF-α促气道平滑肌细胞增殖中的作用。以期为哮喘气道重建的防治提供新思路。本课题分为五部分。第一部分 慢性哮喘小鼠模型的建立目的:建立小鼠慢性哮喘模型。方法:将OVA20μg加2.6mg氢氧化铝溶于PH为7.4的PBS0.2ml中,于第0、7、14天给BALB/c小鼠腹腔注射;于第20天至第29天、第47天、第61天、第73天至第75天鼻腔内滴入OVA抗原液100μg。常规病理切片观察小鼠肺内炎症情况、气管壁厚度及气道平滑肌厚度。检测BALF中细胞数。测定气道对腺苷、乙酰胆碱的反应性。结果:OVA致敏、激发后小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛;气管、支气管及血管周围大量炎症细胞聚集;BALF中白细胞总数、嗜酸细胞及淋巴细胞均较对照组显著升高(P<0.01);气管壁及气道平滑肌增厚(P<0.01);气道对腺苷、乙酰胆碱的反应性增高(P<0.01)。结论:用OVA致敏、激发,可以成功建立小鼠慢性哮喘模型。第二部分 慢性哮喘小鼠肺内EGFR及其配体TGF-α的表达 目的:探讨EGFR系统在慢性哮喘小鼠气道重建中的作用。方法:建立慢性<WP=6>哮喘小鼠模型,ELISA法测定BALF中TGF-α的浓度,RT-PCR观察小鼠肺部EGFR mRNA的表达,免疫组化及Western Blot观察EGFR蛋白的表达。结果:慢性哮喘组小鼠BALF中TGF-α浓度、肺组织EGFR mRNA及EGFR蛋白的表达较正常对照组均增高(P<0.01)。结论:慢性哮喘小鼠BALF中TGF-α的浓度、肺组织EGFR的表达增高。第三部分TGF-α对小鼠气道平滑肌细胞的促增殖作用及其机制 目的:探讨TGF-α对小鼠ASMC促增殖作用及其机制。方法:分离和培养正常小鼠气道平滑肌细胞。免疫组化观察ASMC EGFR的表达。用四唑盐(MTT)比色法和3H-TdR掺入法测定加入TGF-α ASMC增殖情况。采用3H-TdR掺入法和MTT法观察AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin对TGF-α促ASM增殖的影响。用Western Blot方法测定加入不同浓度TGF-α、不同时间及加用AG1478、225mAb后ASMC磷酸化EGFR蛋白表达。结果:用MTT和3H-TdR掺入法测定ASMC培养液中加入TGF-α后ASMC增殖比对照组明显增加,并呈时间和浓度依赖性(P<0.01)。AG1478、225mAb、U0126、Wortmannin抑制TGF-α促ASMC增殖(P<0.01)。免疫组化显示EGFR表达于ASMC 细胞膜上。经Western Blot检测,TGF-α引起ASMC磷酸化EGFR蛋白表达增高,并呈时间和浓度依赖性(P<0.05)。AG1478、225mAb抑制TGF-α所致ASMC磷酸化EGFR蛋白表达的增加(P<0.01)。结论:TGF-α激活EGFR为磷酸化EGFR,从而通过:1 ras-raf-MEK-erk/MAPK途径;2 PI3K-PKC-IKK途径,促进体外培养的小鼠ASMC的增殖。第四部分 EGFR在IL-13、TNF-α促小鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用 目的:探讨EGFR在IL-13、TNF-α促体外培养小鼠ASMC增殖中的作用。方法:分离和培养正常小鼠ASMC。用台盼蓝染色计数分别加入IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α后,ASMC活细胞数。采用3H-TdR掺入法和MTT法观察AG1478、225mAb、TGF-α中和抗体, EGF中和抗体, HB-EGF中和抗体对IL-13、TNF-α促ASMC增殖的影响。用ELISA法测定各组细胞培养上清液中TGF-α的浓度,RT-PCR检测各组ASMC EGFR mRNA的表达,Western Blot检测ASMC EGFR蛋白和磷酸化EGFR蛋白的表达。结果:ASMC细胞数及3H-TdR掺入量,IL-13、TNF-α、IL-13+TNF-α组较对照组增多,IL-13+ TNF-α组增多最为明显,IL-13组次之(P<0.05)。IL-13、TNF-α组MTT值及3H-TdR掺入量均较对照组增高(P<0.01),AG1478、<WP=7>225mAb抑制其增高(P<0.01)。经RT-PCR分析,TNF-α组EGFR mRNA的表达较对照组增加(P<0.01)。经Western Blot检测,TNF-α组ASMC EGFR蛋白及磷酸化EGFR蛋白的表达与对照组相比表达增强(P<0.01),IL-13组ASMC磷酸化EGFR蛋白的表达与对照组相比表达增强(P<0.01),加入AG1478、225mAb后抑制ASMC 磷酸化EGFR蛋白的表达的增加(P<0.01)。IL-13+TGF-α中和抗体组、TNF-α+TGF-α中和抗体组MTT值及3H-TdR掺入量分别低于IL-13、TNF-α组。1h、3h IL-13组、TNF-α组细胞上清液中TGF-α量比对照组增加(P<0.01)。结论:IL-13刺激ASMC分泌TGF-α,TGF-α与EGFR结合,EGFR活化,引起体外培养的小鼠ASMC的增殖。TNF-α刺激ASMC分泌TGF-α,及EGFR mRNA和蛋白表达,TGF-α与EGFR结合,EGFR活化,引起体外培养的小鼠气道平滑肌细胞的增殖。第五部分 地塞米松对慢性哮喘小鼠气道重建及EGFR表达的影响 目的:地塞米松对慢性哮喘小鼠气道重建及EGFR系统的影响。方法:建立小鼠慢性?