背景和目的癫痫是神经内科最常见的疾病之一,且在儿童和青少年中发病较高,癫痫对于个人、家庭和社会带来严重的负面影响。在接受规范、合理的抗癫痫药物治疗后,有20%-30%的患者仍有癫痫发作,而成为难治性癫痫。近年来大量的临床及实验性研究均表明炎症反应和炎症因子参与了癫痫的发生发展过程,癫痫反复发作可引起脑内炎症反应,导致脑组织特别是海马等癫痫敏感脑区的病理改变,炎症反应既是癫痫发作的结果,可能也是造成癫痫反复发作的根本原因。因此探索炎症反应在癫痫中的机制可能为癫痫治疗提供新的方向。Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)是第一种被认为识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的受体。PAMPs是由病原体产生的,如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)亦称内毒素,是革兰阴性菌细胞壁的主要成分之一,可被TLR4识别并激活胶质细胞的固有免疫反应。损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)与PAMPs相对应,高迁移率族蛋白(High mobility group protein 1,HMGB1)是一种核染色质成分,正常情况下存在于细胞核中,死亡的细胞释放的HMGB1作为一种DAMP,也可以被TLR4等模式识别受体识别引起与外源性病原体入侵类似的免疫反应。HMGB1-TLR4信号可以活化核转录因子κB(Nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)发生核转移,而NF-κB可以上调细胞因子和其他的炎症调节物的表达[1]。在正常生理状况下,NF-κB与一种核因子抑制蛋白α(Ikappa B-alpha,IκB-α)结合,因而以一种失活状态存在于胞质中。当细胞受到一系列外源性刺激时,IκB发生磷酸化而失活,NF-κB与IκB发生解离,随后迁移进入胞核中并调节促炎性基因的转录[2]。然而关于癫痫患儿及幼年癫痫动物模型中HMGB1、TLR4、IκB的作用,仍缺乏大量的证据支持。本研究在海人酸(kainic acid,KA)诱导幼年大鼠癫痫发作前2h给予LPS预处理,检测急性期海马组织TLR4、HMGB1的基因及蛋白、IκB-α的蛋白表达水平,以及慢性期海马星形胶质细胞增生情况,研究TLR4/IκB/HMGB1通路在癫痫发作中的作用,以及在LPS加重幼鼠癫痫发作中的作用,从而为寻找以炎症信号通路为靶点的抗癫痫治疗方向提供理论依据。材料与方法出生21天的雄性SD鼠85只随机分为模型Ⅰ组(即KA组,n=33),用海人酸(KA)诱导癫痫发作;模型Ⅱ组(即L+K组,n=38),在应用KA前2h腹腔注射LPS;生理盐水对照组(即NS组,n=14),腹腔注射等量生理盐水。观察幼鼠癫痫行为学表现并评分,各组造模成功后存活的动物按照癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)后不同时间点分为3h、24h、21d,平均每个亚组7只。于预定时间点处死大鼠,制备海马组织匀浆液及石蜡切片标本。荧光定量PCR检测癫痫持续状态(SE)后3h和24h各组海马TLR4和HMGB1基因的表达,Westernblot检测SE后3h、24h各组海马区TLR4、HMGB1、核因子抑制蛋白α(IκB-α)蛋白的表达,免疫组化(IHC)观察SE后21d各组海马星形胶质细胞的增生。采用SPSS 17.0软件进行统计分析,模型组各时间点与生理盐水组间的比较及两模型组间比较均采用t检验,显著性水准为α<0.05。结果1.行为学改变:模型Ⅰ组共33只SD鼠达SE并存活23只(造模成功率93.9%),造模失败2只,死亡8只(死亡率24.2%);模型Ⅱ组共38只SD鼠达SE并存活24只(造模成功率100%),造模失败0只,死亡14只(死亡率36.8%);在急性期模型Ⅰ组和模型Ⅱ组大鼠均有进食进水减少、激惹、攻击性增强等表现,但模型Ⅱ组较模型Ⅰ组更加明显。生理盐水组14只大鼠均未死亡或发生癫痫发作。2.对照组海马区TLR4及HMGB1基因表达量均较低,SE后不同时间点模型Ⅰ组与模型Ⅱ组海马区TLR4及HMGB1基因表达量均比对照组显著增加(差异有统计学意义,P<0.05)。SE后3h模型Ⅱ组海马区TLR4基因表达倍数比模型Ⅰ组显著增加(差异有统计学意义,P<0.05),SE后24h模型Ⅱ组海马区TLR4基因表达倍数与模型Ⅰ组无显著差异(P>0.05),SE后3h、24h模型Ⅱ组海马区HMGB1的表达量与模型组同时间点无显著差异(P>0.05)。3.癫痫急性期海马区TLR4、IκB-α的蛋白表达均显著增加(P<0.01),LPS预处理可显著增加TLR4、IκB-α表达(P<0.05),对HMGB1的表达量无显著性影响(P>0.05),HMGB1总蛋白水平在各组间无显著性差异(P>0.05)。4.对照组海马CA1区及CA3及均有少量的GFAP阳性细胞存在,模型Ⅰ组和模型Ⅱ组与对照组比较GFAP阳性细胞数均显著性增加(P<0.05),且模型Ⅱ组比模型Ⅰ组显著性增加(P<0.05)。结论1.幼年大鼠癫痫急性期海马HMGB1/TLR4基因表达增加,LPS预处理可以增加TLR4基因的表达,并加重慢性期海马星形胶质细胞的增生;2.LPS预处理可以使TLR4蛋白表达量升高,诱导IκB-α磷酸化,加重脑内炎症反应,加重癫痫发作。