论文部分内容阅读
背景： 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以高度磷酸化的tau蛋白缠结出现，Aβ蛋白的沉积以及神经元丢失为病理学特征的慢性神经退行性疾病[1,4,5]。对于其发病机制的研究，近几年来研究人员逐渐在关注中枢神经细胞的能量代谢与失衡。代谢异常或障碍将会影响神经突触的形成以及神经元的功能，因此可能与 AD的发病相关。硫胺素缺乏（Thiamine Deficiency,TD）时，可造成哺乳动物脑中特定区域，如丘脑、中脑、脑干、及小脑等处神经元的特异性死亡，而此特征则是许多与衰老相关的神经退行性疾病，如AD、PD（Parkinson’sdisease,PD）等的共同特征。TD所造成的中枢神经系统损伤的表现被称为脑型维生素B1缺乏症，即韦尼克-科尔萨科夫综合征（Wernicke Korsakoff’s syndrome,WKS）[7,8],与老年退行性疾病的病理特征和临床表现相同。同时TD可使细胞内糖酵解途径以及三羧酸循环出现障碍，导致ATP产生受阻，因此产生细胞能量代谢障碍[6,7]，从而影响神经元对乳酸的利用。近来证据显示，乳酸不仅是神经元重要的能量代谢底物[11]，还是促进学习记忆形成的关键因素[9,10]。而单羧酸转运蛋白（monocarboxylate transporters,MCTs）作为一类转运乳酸等单羧酸物质的跨膜转运蛋白[12]，已有研究证实，其家族中的MCT2与MCT4存在于神经细胞内，并参与乳酸在胶质细胞和神经元之间进行转运[13-17]。据此，我们推测MCT2与MCT4介导的乳酸转运不仅是脑内能量代谢的重要组成部分，更与AD的发病和记忆力减退密切相关。因此，对MCT2和MCT4在TD化AD模型小鼠脑神经细胞中的改变进行研究，有助于为AD疾病的发病机制研究提供新的思路。 目的： 通过探讨MCT2，MCT4在硫胺素缺乏的APP/PS1双转基因AD模型小鼠脑内神经元中的表达改变，以及其与模型小鼠AD疾病表现的联系，为探索AD疾病发病机制提供实验依据。 方法： 1.选取2月龄的APP/PS1双转基因阿尔茨海默病模型雄性小鼠和同月龄相同基因背景C57BL/6J野生型雌性小鼠（Wild Type，WT）交配繁育F1代，组织提取DNA进行基因型鉴定。 2.小鼠脑部图谱的定位下进行小鼠右侧海马齿状回的维生素B1拮抗剂注射，制作动物硫胺素缺乏（Thiamine Deficiency,TD）模型，同时使用0.9％的生理盐水右侧海马齿状回注射作为control组。 3.在TD处理之前和TD处理后3d和7d时分别使用主动规避仪和被动规避仪进行行为学检测。 4.TD处理后3d和7d取出脑组织使用免疫组化，免疫荧光，Western Blot和RT-PCR方法检查小鼠海马区神经元细胞中MCT2和MCT4的位置和表达变化，以及DNA拷贝数量的改变 结果： 1.APP/PS1双转基因小鼠鉴定的目的基因大小为350 bp，选取具有目的基因的小鼠作为阿尔茨海默病模型小鼠。 2.行为学检测结果显示：在被动规避实验中，APP/PS1小鼠TD处理前较TD处理后STL时间由20.5±0.9 s增加为42.4±0.3 s(P<0.05)，WT小鼠TD处理前较TD处理后STL时间由19.9±0.9 s增加为36.5±0.9 s(P<0.05)；在主动规避实验中，APP/PS1小鼠TD处理前较TD处理后条件反应由45±0.2次减少为40±0.2次(P<0.05)，非条件反应由41±0.3次增加至43±0.2次(P<0.05)，无反应由2.5±0.2次增加至5.3±0.7次(P<0.05)，WT小鼠TD处理前较TD处理后条件反应由49±0.7次减少为41±0.4次(P<0.05)，非条件反应由43±0.2次增加至49±0.1次(P<0.05)，无反应由2.2±0.4次增加至4.6±0.2次(P<0.05)。 3.Western Blot结果显示TD处理后，APP/PS1双转基因小鼠和WT小鼠脑内海马区神经元内的MCT2和MCT4蛋白表达量均较control组明显增加，其中APP/PS1小鼠MCT2表达量TD组（2.32±0.06）较control组（0.37±0.04）增高(P<0.05)，MCT4表达量TD组（4.75±0.06）较control组（1.85±0.02）增高(P<0.05)，WT小鼠MCT2表达量TD组（3.01±0.04）较control组（1.12±0.03）增高(P<0.05)，MCT4表达量TD组（9.82±0.06）较control组（1.97±0.04）增高(P<0.05)。 4.RT-PCR结果显示WT小鼠在TD处理后随时间延长而MCT2和MCT4表达量增加明显，即TD处理后MCT2拷贝量7 d（4.27±0.02）较3d（2.61±0.05）增高(P<0.05)，MCT4拷贝量7 d（11.22±0.03）较3 d（7.65±0.04）增高(P<0.05)，而APP/PS1小鼠则随时间延长表达量呈逐渐减少的趋势，即TD处理后MCT2拷贝量7 d（1.45±0.06）较3 d（2.07±0.04）降低(P<0.05)，MCT4拷贝量7 d（2.01±0.04）较3 d（5.84±0.03）降低(P<0.05)。 结论： 硫胺素缺乏可引起单羧酸转运蛋白在阿尔茨海默病模型小鼠海马区神经元表达量的改变。