研究背景：　　骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是一种在儿童和青少年中较为常见的恶性骨肿瘤，具有高度转移的潜能。虽然手术联合辅助化疗已明显提高患者的5年生存率至70%，但疗效仍然急待提高；同时，常规化疗药物的毒副作用较大易致患者预后不良。因此，积极寻找新的、安全有效的抗骨肉瘤药物具有重要的意义。　　葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins, GSP)为一类从葡萄籽中分离提取的聚多酚化合物。研究表明：GSP低毒，且可调节免疫、减轻机体损伤、抗氧化和抗炎等，还能抑制肺癌、胃癌和乳腺癌等多种肿瘤生长，发挥抗肿瘤作用。但是其对骨肉瘤的作用及机制仍不清楚。　　目的：　　本文拟通过研究GSP对骨肉瘤细胞增殖、迁移、凋亡、周期及骨肉瘤体内生长的影响及其分子机制，以探讨其是否具有抗骨肉瘤作用。　　方法：　　1 GSP对骨肉瘤细胞增殖、迁移、凋亡和周期的影响　　经GSP处理骨肉瘤细胞系143B和MG63后，用普通倒置显微镜观察细胞的形态学改变；采用MTT法和克隆形成试验分别检测GSP对骨肉瘤细胞增殖活力和集落形成能力的影响；利用划痕愈合试验和Transwell试验检测GSP对骨肉瘤细胞的迁移能力的影响；采用流式细胞术分析GSP对骨肉瘤细胞凋亡和周期的影响。　　2 GSP影响骨肉瘤细胞增殖和迁移、MET和凋亡的机制　　(1) GSP影响骨肉瘤细胞增殖和迁移的机制　　GSP处理骨肉瘤细胞系143B和MG63后，应用Western Blot法分析其Wnt/β-catenin通路中信号分子(GSK3β、p-GSK3β和β-catenin)和下游靶分子(c-myc、MMP-7和cyclinD1)的变化；　　通过重组腺病毒Adβ-catenin感染骨肉瘤143B和MG63细胞以过表达β-catenin；采用MTT法和Transwell试验分别检测过表达β-catenin对GSP抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移作用的影响；应用Western Blot法检测Wnt/β-catenin信号通路的相应变化。　　(2) GSP对骨肉瘤细胞MET的影响　　Western Blot法和RT-PCR法分别检测MET相关分子E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist的表达变化。　　(3) GSP影响骨肉瘤细胞凋亡的机制　　Western Blot法检测 GSP处理后骨肉瘤细胞中凋亡相关分子Cleaved caspase-8和Cleaved PARP的变化。　　3 GSP对人骨肉瘤裸鼠移植瘤的影响　　将体外培养生长状况良好的人骨肉瘤143B细胞接种到6只裸鼠右侧胫骨端，建立人骨肉瘤裸鼠移植瘤模型。所有模型鼠被随机分为对照组和GSP组，每组3只。每天用GSP或生理盐水为裸鼠灌胃，观察各组裸鼠生长情况，每5天测量体重和肿瘤体积。观察30 d后，处死裸鼠取出瘤体；瘤组织经石蜡包埋、切片，HE染色后观察肿瘤细胞形态，免疫组织化学染色法检测β-catenin和Caspase-3的变化。　　结果：　　1 GSP对骨肉瘤细胞增殖、迁移、凋亡和周期的影响　　GSP抑制骨肉瘤细胞的增殖活力，且呈时间和剂量依赖性；同时， GSP降低骨肉瘤细胞的集落形成能力、抑制其迁移、促其凋亡，并使细胞阻滞在G0/G1期。　　2 GSP影响骨肉瘤细胞增殖、迁移和凋亡的机制探讨　　(1) GSP影响骨肉瘤细胞增殖、迁移的机制　　骨肉瘤细胞经GSP处理后， GSK3β蛋白水平上调， p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1、c-myc和MMP-7蛋白水平明显下降，提示GSP能抑制骨肉瘤细胞Wnt/β-catenin信号通路活性。　　重组腺病毒Adβ-catenin感染骨肉瘤细胞后，β-catenin的过表达明显逆转GSP对骨肉瘤细胞增殖和迁移的抑制，同时也减弱GSP对β-catenin及下游靶分子表达的下调。提示Wnt/β-catenin信号通路的抑制参与介导GSP对骨肉瘤细胞增殖和迁移的抑制作用。　　(2) GSP对骨肉瘤细胞MET的影响　　GSP分别上调和下调骨肉瘤细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白水平，也下调Snail和Twist的mRNA水平，提示GSP促进骨肉瘤细胞的MET。　　(3) GSP影响骨肉瘤细胞凋亡的机制　　GSP处理后，骨肉瘤细胞中的凋亡相关分子Cleaved caspase-8和Cleaved PARP明显增加，提示GSP激活其Caspase凋亡通路。　　3 GSP对人骨肉瘤裸鼠移植瘤的影响　　GSP组与对照组的裸鼠体重无明显差异，但是GSP组裸鼠瘤体生长速度缓慢、瘤体较小，提示GSP抑制骨肉瘤裸鼠移植瘤的生长；与对照组相比，HE染色的GSP组瘤组织中细胞排列整齐紧凑、大小均一，细胞核形状规则，异型性低，提示GSP降低其恶性程度；IHC染色结果显示GSP组的β-catenin减少，而Caspase-3增加，提示GSP抑制其生长的机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的抑制和Caspase凋亡通路的激活，与体外实验结果一致。　　结论：　　1 GSP抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和Wnt/β-catenin信号通路活性，促进其凋亡和MET，并诱导G0/G1期阻滞。　　2 GSP对骨肉瘤细胞的Wnt/β-catenin信号通路的抑制是其抑制增殖和迁移的机制之一；GSP抑制细胞迁移和促进凋亡的机制分别与其促进MET和激活 Caspase信号通路有关。　　3 GSP抑制人骨肉瘤裸鼠移植瘤生长，机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的抑制和Caspase凋亡通路的激活，与体外实验结果一致。　　综上，GSP具有抗骨肉瘤的作用。本研究提示低毒性的GSP是一个潜在的抗骨肉瘤药物。