溶菌酶(lysozyme, LYZ)是一种生物活性小分子碱性蛋白,因具有溶解细菌细胞壁导致细菌溶解的作用特性而得名。溶菌酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体中,在机体的非特异性天然免疫中作为效应分子发挥重要作用。具有抗原性弱、稳定性强、抗菌机理独特、不易产生耐药性及进入机体无有害残留等特点。与其它溶菌酶相比,人溶菌酶(human lysozyme, Hlys)具有稳定性好、溶菌活性强等优势。目前人溶菌酶主要从人乳和胎盘中获取,这种方法产量低、成本高,极大地限制了人溶菌酶的应用,实现人溶菌酶的大量高效表达显得尤为重要。本研究通过基因工程方法,利用毕赤酵母表达系统高效表达人溶菌酶。在GenBank数据库中查看人溶菌酶基因(FJ795023.1)序列,按照毕赤酵母密码子偏嗜性重新设计并合成人溶菌酶基因,通过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切将人溶菌酶基因连接到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA,得到重组质粒pPICZaA-Hlys; SacI线性化pPICZaA-Hlys后,电转化毕赤酵母GS115菌株感受态细胞,在Zeocin抗性浓度为100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPD平皿筛选重组菌。根据pPICZaA的醇氧化酶启动子设计上下游引物：5’-AOX1和3’-AOX1引物,PCR鉴定阳性重组子,共筛选出6株含目的基因的重组菌株。将重组菌株以甲醇作为碳源进行诱导,SDS-PAGE和Western blot检测到培养基上清中Hlys蛋白的表达。选取表达效果最好的6号重组菌,对摇瓶上的诱导条件进行优化,得出最佳的诱导条件为：pH=7.0,诱导时间72h,甲醇浓度2%。在发酵罐上按照摇瓶诱导的最佳诱导条件进行目的蛋白的大量表达研究,SDS-PAGE检测显示上清中可检测到目的蛋白的表达。电泳凝胶分析表明目的蛋白占总蛋白的30.5%,BCA法测得目的蛋白表达量约为669.78μg/mL/。发酵诱导上清浓缩处理,体外抑菌试验表明重组人溶菌酶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌都有一定的抑菌作用。重组人溶菌酶对多株链球菌的最低抑菌浓度(MIC)范围为96～192μg/mL,最低杀菌浓度(MBC)范围为383～766gg/mL。重组人溶菌酶对多株副猪嗜血杆菌的MIC范围为383～766μg/mL, MBC在766μg/mL以上。发酵上清经超滤浓缩、SephadexG-50凝胶层析分离纯化得到较纯的人溶菌酶蛋白。以溶壁微球菌为底物,快速比浊法测得表达的重组人溶菌酶酶活力为3847.93U/mL,计算得比活力为19233.20U/mg。发酵液中添加冻干保护剂,冷冻干燥,干粉添加在饲料中饲喂小鼠一周,饲料中添加溶菌酶的小鼠体重比未添加组增加3.97%,但是两组间差异不显著。小鼠动物试验结果表明重组人溶菌酶对链球菌感染有一定的预防作用,但治疗效果不明显。