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背景: 小胶质细胞是中枢神经系统内的巨噬细胞,对神经元微环境的变化非常敏感,生理情况下负责清除病原体和异物以维持脑内稳态,持续激活后产生大量的免疫炎性因子,引起对神经元的损伤.糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)是肾上腺皮质分泌的具有广泛生理效应的内源性分子.研究显示糖皮质激素受体(Glucocoticoid receptor,GR)基因敲除和肾上腺皮质切除的大鼠均表现出小胶质细胞活化增强,且对神经性毒物敏感,而补充外源性GCs可以抑制小胶质细胞活化,提示GCs通过抑制小胶质细胞激活参与脑内炎症反应的调节.胆碱能神经抗炎是一种新的炎症反应调节机制,α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)是胆碱能抗炎通路的关键分子.研究显示α7nAChR的激动剂尼古丁或乙酰胆碱均可以抑制LPS刺激引起的小胶质细胞活化及炎症因子产生,提示胆碱能抗炎通路亦与脑内炎症反应相关.由于同时表达GR和α7nAChR,小胶质细胞成为GCs(体液)抗炎和胆碱能(神经)抗炎通路的共同靶标.但两条抗炎通路之间是否存在联系,尚未清楚.因此,本研究通过观察GCs对小胶质细胞α7nAChR的影响,以揭示两条抗炎通路之间的关系. 慢性应激所致的体内GCs升高或长期给予外源性GCs都会导致神经系统炎症反应的敏化,增强小胶质细胞的促炎效应,表现出与生理浓度GCs不同的效应,这一现象提示体内GCs的慢性升高可能与某些脑内炎症相关性疾病相关.故本研究在探讨生理浓度GCs对小胶质细胞α7nAChR影响的基础上,进一步观察高浓度GCs对α7nAChR的作用,以期为慢性应激情况下体内炎症反应的变化提供解释. 第一部分 生理浓度糖皮质激素对小胶细胞α7nAChR的影响 目的: 探讨生理浓度GCs对小胶质细胞7nAChR的影响及其机制. 方法: 1.激光共聚焦显微镜用于观察氢化可的松与小胶质细胞?7nAChR的结合情况. 2.激光共聚焦显微镜动态扫描观察氢化可的松引起小胶质细胞内钙离子浓度的实时变化. 3.激光共聚焦显微镜检测氢化可的松对小胶质细胞?7nAChR数量的影响. 4.Q-PCR法检测氢化可的松对小胶质细胞?7nAChRmRNA表达的影响. 5.Western blot法检测氢化可的松对小胶质细胞7nAChR蛋白表达的影响. 结果: 1.生理浓度氢化可的松与小胶质细胞α7nAChR的结合 激光共聚焦显微镜检测显示300nM氢化可的松可显著降低?-Bgt-FITC与Bv-2细胞的结合,这一作用与阳性对照药尼古丁一致,说明氢化可的松可以结合α7nAChR. 2.生理浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR功能的影响 激光共聚焦显微镜实时扫描显示,300nM氢化可的松可显著引起Bv-2细胞内钙升高,GR拮抗剂RU486不能阻断氢化可的松升高Bv-2细胞内钙的作用,α7nAChR受体拮抗剂MLA则可拮抗这一效应. 3.生理浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR数量的影响 分别给予300nM氢化可的松对Bv-2细胞进行短时(1、3、6、12、24h)和长时处理(2、4、8d),观察对α7nAChR数量的影响.激光共聚焦显微镜检测显示,氢化可的松处理不同时程均不影响Bv-2细胞的α7nAChR数量. 4.生理浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR表达的影响 1)生理浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChRmRNA表达的影响 分别给予300nM氢化可的松对Bv-2细胞进行短时(1、3、6、12、24h)和长时处理(2、4、8d),观察对α7nAChR mRNA表达的影响.Q-PCR检测显示,氢化可的松处理不同时程均不影响Bv-2细胞α7nAChRmRNA表达. 2)生理浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR蛋白表达的影响 分别给予300nM氢化可的松对Bv-2细胞进行短时(1、3、6、12、24h)和长时处理(2、4、8d),观察对α7nAChR蛋白表达的影响.Western blot检测显示,氢化可的松处理不同时程均不影响Bv-2细胞α7nAChR蛋白表达. 小结: 1.生理浓度GCs可以与α7nAChR结合,并引起小胶质细胞内钙离子浓度升高,这一作用与α7nAChR开放有关,提示GCs可作为α7nAChR内源性配体. 2.生理浓度GCs处理小胶质细胞不同时程对α7nAChR的数量和表达均不影响. 第二部分 高浓度糖皮质激素对小胶细胞α7nAChR的影响 目的: 探讨高浓度GCs对小胶质细胞7nAChR的影响及其机制. 方法: 1.膜片钳技术检测小胶质细胞内向电流的变化. 2.ELISA法检测细胞培养上清中炎症因子TNF-α的含量.其余方法同第一部分. 结果: 1.高浓度氢化可的松与小胶质细胞α7nAChR的结合 1000nM氢化可的松可显著降低α-Bgt-FITC与小胶质细胞的结合,这一作用与生理浓度氢化可的松一致. 2.高浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR功能的影响 1)1000nM氢化可的松引起Bv-2细胞内钙升高的效应与生理浓度氢化可的松一致. 2)1000nM氢化可的松诱导Bv-2细胞产生内向电流,这一作用可被MLA拮抗. 3.高浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR数量的影响 分别给予1000nM氢化可的松对Bv-2细胞进行短时(1、3、6、12、24h)和长时处理(2、4、8d),观察对α7nAChR数量的影响.激光共聚焦显微镜检测显示,高浓度氢化可的松短时处理不影响α7nAChR数量,而长时处理可增加Bv-2细胞α7nAChR的数量. 4.高浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR表达的影响 1)高浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChRmRNA表达的影响 分别给予1000nM氢化可的松对Bv-2细胞进行短时(1、3、6、12、24h)和长时处理(2、4、8d),观察对α7nAChRmRNA表达的影响.Q-PCR检测显示,高浓度氢化可的松短时处理不影响α7nAChR mRNA表达;而高浓度氢化可的松处理Bv-2细胞4天可引起α7nAChR mRNA表达增加,第8天无明显变化. 2)高浓度氢化可的松对小胶质细胞α7nAChR蛋白表达的影响 分别给予1000nM氢化可的松对Bv-2细胞进行短时(1、3、6、12、24h)和长时处理(2、4、8d),观察对α7nAChR蛋白表达的影响.Western blot检测显示,高浓度氢化可的松短时处理不影响α7nAChR蛋白表达;而高浓度氢化可的松处理Bv-2细胞8天可引起α7nAChR蛋白表达增加. 5.α7nAChR参与高浓度氢化可的松的抗炎作用 ELISA检测结果显示,1000nM氢化可的松可以抑制LPS诱导的炎症反应,MLA可以拮抗这一效应,提示α7nAChR参与高浓度氢化可的松的抗炎作用. 小结: 1.高浓度GCs对α7nAChR的功能影响与生理浓度一致. 2.高浓度GCs长时处理可以上调小胶质细胞α7nAChR的数量和表达. 3.α7nAChR参与糖皮质激素的抗炎作用. 全文结论: 本研究在小胶质细胞证实GCs可与α7nAChR结合,并通过开放α7nAChR引起细胞内钙浓度增加,不仅揭示以GCs为代表的体液抗炎通路和以α7nAChR作为关键分子的胆碱能抗炎通路之间存在联系,也拓展了GCs药理作用的非基因组效应,提示GCs可能作为α7nAChR的潜在内源性配体.生理浓度和高浓度GCs对α7nAChR表达的不同影响,提示慢性应激情况下体内抗炎通路出现了改变,可能与脑内炎症相关性疾病的发生有关.