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黑腹果蝇作为研究先天免疫机制的模式生物,在免疫学史上起到了里程碑式的重要作用。对于果蝇的先天性免疫研究科学家们已大致掌握了它的机理,果蝇的先天免疫包括体液免疫、细胞免疫以及黑化反应三方面,其中Toll免疫信号通路和Imd免疫信号通路是果蝇最重要的体液免疫方式。而Toll通路是果蝇中被广泛了解的重要通路之一。其作用机制是主要通过一系列信号传导、级联反应抵抗革兰氏阳性菌以及病原体的入侵。已有大量研究表明,microRNA(miRNA)在果蝇免疫信号传递过程中发挥着重要的调控作用。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的小非编码RNA,长度约为20个核苷酸,通过结合靶基因mRNA的特定靶位点发挥其调控转录后水平的基因表达的作用,进而调控生物体的各种生理活动。然而目前,虽然有关Toll信号通路的机制的研究报道已经十分透彻了,但对于果蝇Toll信号通路相关miRNA的研究却不够清晰。故本论文采用实验生物学和生物信息学有机结合的方法,针对miRNA能否调控果蝇Toll信号通路设计如下相关实验。通过体内、体外实验证明果蝇miR-959能够直接靶向tube基因来调控Toll信号通路。本论文所取得的主要实验研究结果如下;1.利用Tub-Gal80ts/+;Tub-Gal4系统果蝇与UAS-miR-959/960/961/962果蝇杂交,得到miR-959/960/961/962高表达的果蝇株,通过实时荧光定量(qRT-PCR)检测高表达果蝇在感染革兰氏阳性菌藤黄微球菌(M.luteus)后(0h、6h、12h、24h、48h和72h)抗菌肽的表达量,确认其免疫相关性。随后又检测分别高表达miR-959、miR-960、miR-961、miR-962果蝇在RNA水平抗菌肽Drs的表达量。结果显示miR-959在12h时Drs的表达量显著下降。并且对miR-959/960/961/962这一簇果蝇中的每个miRNA分别在其高表达果蝇中检测miRNA的表达量,再通过Western Blotting实验进一步验证,确定miR-959具有免疫相关性。2.采用革兰氏阳性菌刺激野生型果蝇,在RNA水平分时间点(0h、3h、6h、12h、24h、48h)检测果蝇体内的miR-959表达量,在6个时间点表达量都上调并在12h时miR-959的表达量显著升高,达到峰值,这表明miR-959被阳性菌刺激后在野生型果蝇中可能具有Toll信号通路的免疫相关性。3.为进一步研究miR-959影响果蝇Toll通路的作用机制,我们通过TargetScan和miRanda两种生物信息学预测软件预测了miR-959可能靶向的基因是tube。4.采用双荧光素酶报告系统在果蝇S2细胞内验证miR-959与靶基因tube的相互关系,直接证明tube是miR-959的靶基因。5.在果蝇体内利用qRT-PCR再次验证了miR-959和tube基因的靶标关系,进一步证实miR-959通过靶向tube抑制抗菌肽的表达。6.构建高表达miR-959与miR-959sponge杂交为一体的补偿型果蝇果蝇,再进一步地确定了miR-959在果蝇体内对Toll通路负调控作用。综上所述,我们通过对miR-959/960/961/962这一簇miRNA的免疫相关性的确定,发现这簇miRNA中只有miR-959可能负调控果蝇Toll免疫信号通路,并进一步探究了miR-959发挥这一功能的内在机制。最终发现miR-959通过结合靶基因tube的3’UTR,影响其正常表达,从而减少抗菌肽Drs的表达实现对Toll信号通路的负调控。本课题为探究miRNA在先天免疫中的功能资料库补充了相关研究参考。