论文部分内容阅读
研究背景目前中国约有900万左右的癫痫患者,且每年新增癫痫患者多达40万左右。临床以抗癫痫药物对症治疗为主,但仍约30%的癫痫患者发作难以控制,故疗效欠佳。积极探索其形成机制并寻找针对病因的特异性治疗手段是目前癫痫研究的热点。近年来研究发现,星形胶质细胞神经炎症与癫痫形成密切相关,且具有抗炎作用的生物活性物质ε-viniferin在神经退行性疾病中发挥的神经保护作用正日益受到关注。本研究前期工作已发现NLRC4炎症小体在星形胶质细胞中高表达及其活化相关的神经炎症在海人酸（Kainic acid.KA）诱导的癫痫持续状态（Status epilepticus,SE）小鼠海马区损伤中的重要作用,故在此基础上,本研究通过KA诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A,分析NLRC4炎症小体活化在KA诱导后的星形胶质细胞相关神经炎症中的作用及ε-viniferin的干预效应,为发现癫痫形成过程中星形胶质细胞神经炎症的关键分子及其干预策略提供理论和实验依据。研究方法1、分析KA对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β表达的影响:（1）KA作用浓度与时间筛选:用不同浓度的KA（10μm、25μm、50μm、100μm）诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 24h（KA-50μm组增加48h作用时间点）,对照组加入等量的完全培养基培养24h与48h通过CCK8检测各组细胞存活率;通过ELISA检测不同KA作用浓度及时间点下各组细胞IL-1β的分泌量;（2）采用50μm KA或完全培养基诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 48h后,通过Western blotting检测细胞中标记物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）、NLRC4、Caspase-1/P20/P10 和 Cleaved-IL-1β 蛋白的表达。2、分析沉默NLRC4的表达对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4、Caspase-1、IL-1β表达的影响:（1）向小鼠星形胶质细胞株C8-D1A转染沉默NLRC4基因的短发卡RNA（NLRC4 shRNA）慢病毒载体（sh-NLRC4组）或作为阴性对照的Vehicle shRNA慢病毒空载体（sh-CON组）,通过荧光显微镜观察NLRC4 shRNA慢病毒是否成功感染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A;通过RT-qPCR及Western blotting检测NLRC4 shRNA慢病毒对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A内NLRC4表达的抑制效应;（2）应用NLRC4 shRNA慢病毒或Vehicle shRNA慢病毒转染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A,加用50μm KA诱导48h,分为四组;sh-CON组、sh-CON+KA-50μm组、sh-NLRC4 组、sh-NLRC4+KA-50μm 组。分别通过 Western blotting 及 ELISA 法检测各组细胞中NLRC4及Caspase-1/P20/P10、Cleaved-IL-1β蛋白的表达及IL-1β的分泌。3、分析ε-viniferin对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及Caspase-1、IL-1β表达的影响:（1）应用1μm ε-viniferin作用小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 24h,分为三组:control组、溶剂对照DMSO组、vinifelin组。通过CCK8检测各组细胞存活率;（2）应用50μm KA诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 48h,加用 1μm ε-viniferin 预处理 24h,分为四组:control 组、KA 组、vinifelin+KA组、vinifelin组。分别通过Western blotting及ELISA法检测各组细胞中NLRC4及Caspase-1/P20/P10、Cleaved-IL-1β 蛋白的表达及 IL-1β 的分泌。结果1、KA对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β表达的影响:（1）KA作用浓度与时间筛选:小鼠星形胶质细胞株C8-D1A经不同浓度KA诱导24h后,KA-10μm组、KA-25μm组、KA-50μm组细胞存活率均较KA-0μm组显著增高（P＜0.05）,且以KA-10μm组、KA-25μm组更为明显（P＜0.01）,而KA-100μm组细胞存活率较KA-0μm组显著下降（P＜0.01）;KA-50μm组、KA-100μm组培养液中IL-1β分泌量较KA-0μm组显著增高（P＜0.01）,且KA-50μm-48h组条件性培养液中IL-1β分泌量较KA-0μm-48h组及KA-50μm-24h均存在显著增高（P＜0.01）;（2）Western blotting结果显示,与对照组相比,KA-50μm组细胞内GFAP蛋白表达较明显升高（P＜0.05）;与对照组相比,KA-50μm组NLRC4、下游信号蛋白Caspase-1活性体Caspase-1/P20/P10、炎症因子IL-1β剪切体Cleaved-IL-1β蛋白表达均明显升高（P＜0.01）。2、沉默NLRC4的表达对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4及Caspase-1、IL-1β表达的影响:（1）NLRC4 shRNA慢病毒转染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A后15d,嘌呤霉素1μg/ml筛选7d后,可在荧光显微镜下观察到,与明场下细胞形态对比,小鼠星形胶质细胞株C8-D1A内存在明显绿色荧光分布;RT-qPCR结果显示,sh-NLRC4组NLRC4 mRNA相对表达量较sh-CON组下降88.12%,差异具有统计学意义（P＜0.01）;Western blotting结果显示,sh-NLRC4组NLRC4蛋白的表达水平较sh-CON组显著降低（P＜0.05）。（2）Western blotting结果显示,与对照组sh-CON组相比,sh-NLRC4组NLRC4蛋白表达明显降低,且与sh-CON+KA-50μm组相比,sh-NLRC4+KA-50μm组NLRC4蛋白表达显著下降（P＜0.01）;与sh-CON+KA-50μm 组相比 sh-NLRC4+KA-50μm 组 Caspase-1/P20/P10、Cleaved-IL-1β蛋白表达亦显著下降（P＜0.01）;ELISA结果显示,与对照组sh-CON组相比,sh-CON+KA-50μm组培养液中IL-1β分泌量显著降低（P＜0.01）;与sh-CON+KA-50μm组相比,sh-NLRC4+KA-50μm组IL-1β分泌量亦显著降低（P＜0.05）,但仍显著高于sh-NLRC4 组（P＜0.01）。3、ε-viniferin对KA诱导的的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及Caspase-1和炎症因子IL-1β表达的影响:（1）CCK8检测结果显示,与control组相比,vinifelin组小鼠星形胶质细胞株C8-D1A细胞存活率有所下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与DMSO组相比,vinifelin组细胞存活率亦有所下降（P＜0.01）,但仍可在90%以上,提示此浓度对细胞活力影响较小,可选择1μm作为本实验ε-viniferin预处理的干预浓度。（2）Western blotting及ELISA结果表明,KA组小鼠星形胶质细胞株 C8-D1A 较 control 组相比 NLRC4、Caspase-1/P20/P10、Cleaved-IL-1β的表达以及IL-1β分泌量显著增加（P＜0.01）;vinifelin+KA组较KA组相比,NLRC4、Caspase-1/P20/P10、Cleaved-IL-1β的表达以及培养液内IL-1β分泌量下调（P＜0.05）。结论1、KA诱导可促进小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体的活化及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β的表达上调。2、沉默NLRC4的表达可显著降低KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中Caspase-1、IL-1β蛋白的表达,提示NLRC4炎症小体是KA相关的小鼠星形胶质细胞神经炎症中促炎症因子分泌的主要来源。3、ε-viniferin预处理可显著抑制KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体的活化以及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β的表达。