随着医学的发展，产前诊断已成为现代妇产科发展的重点。但是，目前产前诊断还主要建立在有创性手术的基础上，这些有创性手术存在导致1-5﹪左右胎儿流产的风险。孕妇血浆中胎儿DNA的发现已为无创性产前诊断提供了可能性。目前，有关孕妇血浆DNA的应用研究主要集中在两大方面：一是与病理妊娠疾病关系的研究，如先兆子痫、早产、胎儿宫内发育迟缓、妊娠剧吐以及侵入性胎盘等，这些病理妊娠的孕妇血浆或血清中胎儿DNA表现为异常增高，而且DNA增高比出现以上临床症状早，起到临床预测的价值；二是孕妇血浆胎儿DNA在产前基因诊断的应用研究，因血浆DNA中孕妇自身DNA占90﹪以上，因此，该类应用研究目前还只能局限于一些在胎儿DNA和孕妇DNA基因型不同的遗传疾病的排除诊断，如性连锁疾病、孕妇Rh血型阳性的胎儿RhD血型状态以及父亲遗传的基因等遗传病。然而，目前在孕妇血浆胎儿DNA应用研究方面仍然存在一些棘手的问题，首先，是缺乏有效的胎儿标记物，因为目前应用广泛的胎儿标记物是Y染色体上的性别决定区基因(sex determining region on Y，SRY)，它只能代表男性胎儿的DNA，因此，必须找到一种非性别依赖的血浆DNA，才能用来有效、全面地监测病理性妊娠疾病。其次，是怎样从在占血浆DNA90﹪以上的孕妇DNA中分离出胎儿DNA，并进行有效的产前基因诊断。 第1章孕早期出现先兆流产孕妇血浆DNA水平和妊娠结局的关系。 研究背景：先兆流产(Threatened Abortion，TA)是最常见的一种孕早期病理妊娠疾病，发病率有30-40﹪。出现先兆流产症状的孕妇中，有约15﹪发生自然流产，因该类高危人群发生自然流产的概率很高，所以临床上需要一种有效预测妊娠结局的方法，但是目前临床上常用的血清β-HCG和超声诊断指标的预测价值均不理想。 目的：(1)检测正常孕妇在孕早期(6-11.6周)的血浆总DNA和胎儿DNA水平；(2)通过检测不同实验组孕妇血浆中总DNA和胎儿DNA的水平，观察能否利用孕妇血浆中总DNA和胎儿DNA来预测孕早期出现先兆流产的孕妇是否会发生自然流产。 方法：该研究是一项前瞻性研究，根据妊娠结局分为三组：自然流产组(A组)、先兆流产但妊娠结局正常组(B组)、正常对照组(C组)。DYSl4和β-globin基因分别用来代表胎儿DNA和血浆总DNA，应用实时定量PCR方法检测上述各实验组孕妇血浆总DNA和胎儿DNA的含量。 结果：共检测了1114名孕早期孕妇的血浆标本，发现：(1)正常孕妇在孕早期(6-11.6周)，血浆总DNA和胎儿DNA的含量都随着孕周的增长而增高；(2)自然流产组孕妇血浆总DNA和胎儿DNA的中位数倍值分别是正常对照组4倍和5倍，有统计学差异(p<0.01)，而两者含量在有先兆流产但妊娠结局正常组与正常对照组之间无统计学差异(p>0.01)；(3)若用血浆总DNA的1.6 MoMs来预测A然流产，灵敏度为98.2﹪，假阳性率为4.7﹪；而用胎儿DNA的1.8 MoMs来预测自然流产，灵敏度为97﹪，但是假阳性率为44.3﹪。 结论：在孕早期，孕妇血浆总DNA和胎儿DNA的水平随着孕周的增长而增高；发生自然流产的孕妇血浆中总DNA和胎儿DNA水平都明显高于妊娠结局正常的孕妇；对于发生先兆流产的孕妇，其在孕早期的血浆总DNA比血浆中胎儿DNA更具有预测自然流产的临床价值，有望成为临床上预测发生先兆流产孕妇妊娠结局的新生物学指标。 第2章有效富集孕妇血浆中胎儿DNA的分离。 研究背景：目前产前诊断还建立在有创性手术的基础上，这些手术有一定的危险性，可以导致1-5﹪左右的胎儿发生流产。孕妇血浆中的胎儿DNA的发现为无创性产前诊断提供了可能，但是血浆DNA中孕妇自身的DNA占90﹪以上。因此，如何选择性地富集胎儿DNA，是实现无创性产前诊断的关键。最近有研究发现，孕妇血浆DNA中胎儿DNA分子片段长度小于孕妇自身DNA，为从DNA片段大小上将胎儿DNA分离出来提供了实验依据。 目的：建立一种简单、有效地富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法。 方法：收集了25份B超诊断为男性胎儿、孕17-34周的正常孕妇外周血，将盐析与酚-氯仿方法相结合并进行改进，提取血浆DNA，同时与QIAGEN试剂盒提取方法比较。再利用一纯化PCR产物的过滤膜装置过滤提取的血浆DNA，然后用实时定量PCR检测过滤前后的血浆DNA的SRY(代表胎儿DNA)和β-globin(代表血浆总DNA)基因含量，计算胎儿DNA占总DNA的百分比。并且同时用荧光PCR分析13、18、21号染色体上7个小片段重复序列(small tandemrepeating STR)来检测富集的血浆DNA以及父母的外周血DNA，验证富集的血浆DNA是否为胎儿DNA。 结果：改良的酚氯仿提取血浆DNA的方法所提取的血浆DNA中，总DNA和胎儿DNA分别是QIAGEN提取方法所提取的血浆总DNA和胎儿DNA的2倍和8倍左右，为下一步富集胎儿DNA提供更多的血浆DNA。富集之前的血浆DNA中，胎儿DNA平均占血浆总DNA的7.1﹪，富集后的血浆’DNA中，胎儿DNA平均占67.8﹪(45．3﹪-95.1﹪)。所有富集的胎儿DNA经过STR位点分析，结果显示，在7个STR位点中，每个富集的胎儿DNA至少有两个位点可以检测到从父母那里各自遗传了一个等位基因，表明有效地富集了血浆中地胎儿DNA。 结论：本研究建立了一种有效富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法，富集的胎儿DNA有望用于染色体病和基因病等其他遗传性疾病的无创性产前诊断。 第3章无创性产前诊断致死性软骨发育不全胎儿一例。 背景：致死性骨发育不良，先天性软骨发育不全或先天性骨发育不良是临床上最常见的三种先天性侏儒症，它们都是FGFR3基因突变所致，其中，发生致死性骨发育不良的胎儿出生后无法存活。目前这些疾病的产前诊断依赖于侵入性手术。 目的：用以上建立的富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法无创性产前诊断一例怀疑为软骨发育不全的胎儿。 方法:一名孕19周的孕妇，B超诊断怀疑为软骨发育不全的男性胎儿。抽取孕妇外周血20ml，提取血浆DNA，富集胎儿DNA后，实时定量PCR检测富集的血浆DNA中的胎儿DNA和血浆总DNA，计算胎儿DNA占血浆总DNA的百分比。针对目前已知的最常见导致致死性骨发育不全的FGRF3基因的7号外显子上相关突变位点进行测序分析，并将其DNA测序结果与羊水DNA的测序结果相比较。 结果:胎儿DNA占血浆总DNA的92.1﹪；经测序发现胎儿的FGRF3基因7号外显子上的第742号碱基由C杂合突变为T(C→T)，为致死性软骨发育不全Ⅰ型，血浆DNA结果与羊水DNA结果完全吻合。 结论:建立的富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法可用于软骨发育不全等基因病的无创性产前基因诊断。