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果胶酶广泛应用于果汁饮料、造纸工业、棉纤维的煮练、植物韧皮纤维脱胶、咖啡和茶发酵、动物饲料等领域和行业。橙子皮是一种工农业废弃物,含有丰富的果胶,因此利用橙子皮诱导生产果胶酶具有环保和经济双重效益。本文利用橙子皮对果胶酶产生菌株的筛选鉴定、发酵工艺优化、酶的分离纯化和酶学性质进行了研究,研究内容与结果如下:(1)利用平板筛选分离方法,结合摇瓶发酵后果胶酶活力的测定,筛选出一株产果胶酶活力最高的菌株v25,其酶活力为15.13 U/mL。对菌株v25进行菌落形态、显微形态结构观察和基因序列测定与分析,确定该菌株为囊酵母(Zygoascus sp.)。通过测定菌株v25的生长曲线,选取18 h为种子培养时间。(2)运用单因素试验、Plackett-Burman设计和中心复合设计等方法对菌株v25产果胶酶的发酵工艺进行了优化。最适发酵条件为培养基初始pH 5.5、摇床转速160 r/min、接种量4%、装液量25 mL/250 mL、发酵温度31℃、发酵时间48 h。最优发酵培养基组分为橙子皮粉31.2 g/L、蛋白胨1 g/L、牛肉膏3 g/L、K2HPO4.3H2O 0.094 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、CaCl2 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L。在此最优培养基组分下的预测果胶酶活力为28.97 U/mL。在预测最优培养基组分下进行发酵验证性试验,得到的果胶酶活力为29.02 U/mL。实测值与预测值吻合良好,是发酵工艺优化前(15.13 U/mL)的1.918倍。(3)采用(NH4)2SO4盐析、Sephadex G-25凝胶过滤脱盐、DEAE-cellulose A-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等方法,对囊酵母(Zygoascus sp.)v25液体发酵所产的聚甲基半乳糖醛酸酶进行了分离纯化。经SDS-PAGE电泳分析,纯化后的聚甲基半乳糖醛酸酶为电泳纯单一组分,其相对分子质量为75.28kDa,纯化倍数为16.89,回收率为18.46%,比酶活为2469.77 U/mg。(4)聚甲基半乳糖醛酸酶的最适反应温度为60℃、最适反应pH为5.0,且在pH值为3.0~11.0范围内酶活力保持相对稳定。铜离子和半胱氨酸对酶活力有促进作用,汞离子对酶活力有较强的抑制作用。底物专一性试验表明酶解程度与果胶酯化度呈负相关的关系。该聚甲基半乳糖醛酸酶的Km和Vmax分别为5.44mg/mL和61.73μmol/(min·mg)。经薄层层析色谱分析可知,纯化后的酶是一种外切聚甲基半乳糖醛酸酶。纯化后的酶被应用于桔子、橙子、葡萄柚和苹果等四种水果果汁的澄清试验,发现这四种水果果汁在660 nm处的透光率分别增加了3.51%、4.36%、8.04%和12.2%,表明这种聚甲基半乳糖醛酸酶可以应用于果汁澄清处理工艺。